【摘要】：研究背景和目的 急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由各種嚴(yán)重的非心源性致病因素如嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷、誤吸等引起,以急性進(jìn)行性加重的呼吸困難和難治性低氧血癥為主要表現(xiàn)的一種臨床綜合征,嚴(yán)重階段可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。ALI/ARDS發(fā)病率高,病死率高,缺乏特效治療,因而其機(jī)制研究仍受各國科學(xué)家重視。 炎癥反應(yīng)及其誘發(fā)的氧化應(yīng)激是ALI/ARDS重要的發(fā)病機(jī)制。一方面,以腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-a, TNF-a)所代表的細(xì)胞因子大量釋放為特征的全身過度炎癥反應(yīng)是ALI的主要發(fā)病基礎(chǔ)。另一方面,TNF-α能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生大量活性氧(Reactive Oxidative Species, ROS),造成過度的氧化應(yīng)激,與炎癥反應(yīng)協(xié)同加重病情。此外,過度的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)源性ROS生成增多,加重氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡,直接損傷結(jié)構(gòu)細(xì)胞。炎癥及氧化失衡所導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)一步造成肺泡塌陷、肺泡-毛細(xì)血管屏障通透性增加,肺泡腔內(nèi)滲出物增多,誘發(fā)或加重肺水腫、肺不張,引起難以糾正的低氧血癥。因此,針對ALI患者的肺組織保護(hù)策略,除了進(jìn)行有效的抗感染治療,同時(shí)還需對機(jī)體免疫系統(tǒng)合理干預(yù),將過度的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激維持在適當(dāng)水平,保持肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞完整性,維持肺泡-毛細(xì)血管的屏障功能。 急性肺損傷的炎癥反應(yīng)失控表現(xiàn)為促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子的過度激活與失衡。TNF-α是啟動(dòng)和放大炎癥反應(yīng)的主要炎癥介質(zhì)。ALI/ARDS患者、動(dòng)物模型的支氣管肺泡灌洗液或血清中TNF-α白介素-1β、白介素-8、白介素-10等細(xì)胞因子明顯增加,其濃度與疾病進(jìn)展、臨床預(yù)后密切相關(guān)[7]。因此,測定促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子濃度可直觀地評估ALI模型的炎癥反應(yīng)水平。 氧化應(yīng)激的發(fā)生,一方面是由于ROS和/或RNS的產(chǎn)生過多；另一方面是由于抗氧化物質(zhì)的過度消耗。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NADPH oxidase, NOX)包括7種同源蛋白,共同組成NOX/DUOX家族,是產(chǎn)生ROS的重要來源。NOX/DUOX家族各亞型的分布具有組織細(xì)胞特異性,其衍生的ROS的功能也存在差異。吞噬細(xì)胞型ROS主要參與宿主防御,非吞噬細(xì)胞型ROS則可作為第二信使直接或間接作用于信號傳導(dǎo)通路。NOX/DUOX家族各亞型與慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、急性肺損傷等疾病密切相關(guān),但目前尚缺乏各亞型在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分布情況的相關(guān)研究。篩選出與ALI相關(guān)的重要亞型,研究其調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而調(diào)節(jié)其ROS的生成,是下調(diào)ALI氧化應(yīng)激損傷的重要途徑之一。 本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明,NF-κB/p65基因可能通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2表達(dá)比例減少TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。NF-κB是TNF-α促發(fā)、放大炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)核心,可調(diào)控包括NOX/DUOX家族基因在內(nèi)的眾多炎癥疾病相關(guān)因素的表達(dá)。通過干預(yù)NF-κB通路下調(diào)其下游靶基因的表達(dá)水平,可能比單一補(bǔ)充細(xì)胞因子拮抗劑或抗氧化劑效果更好。 啟動(dòng)子(promoter)是RNA聚合酶辨認(rèn)、結(jié)合和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。真核生物RNA聚合酶本身不能直接識別、結(jié)合相應(yīng)的啟動(dòng)子序列,必須經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)輔助才能與之結(jié)合。啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用影響基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程,是研究疾病機(jī)制的重要切入點(diǎn)。生物信息學(xué)軟件分析初步結(jié)果顯示,NOX1啟動(dòng)子近端存在2個(gè)NF-κB結(jié)合元件,NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核后可能通過與該元件結(jié)合,調(diào)控NOX1的轉(zhuǎn)錄過程。因此,明確NF-κB對NOX1基因的調(diào)控機(jī)制,通過下調(diào)NF-κB的活性調(diào)控NOX1生成ROS,理論上可以減輕TNF-α促發(fā)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激程度,為調(diào)控ALI的肺保護(hù)策略研究提供更為精準(zhǔn)的靶基因。 綜上所述,本課題的研究目的如下： 1采用TNF-α刺激肺泡II型上皮細(xì)胞(A549),評估其炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡水平,建立ALI體外細(xì)胞炎癥模型； 2探討NF-KB/p65在TNF-α誘導(dǎo)的炎癥及氧化應(yīng)激損傷病理過程中的作用； 3明確參與TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生炎癥——氧化應(yīng)激病理過程的NOX/DUOX家族亞型,分析其與NF-κB的相關(guān)性； 4探討NF-κB對NOX1的調(diào)控機(jī)制及NOX1啟動(dòng)子區(qū)完整性對NF-κB調(diào)控作用的影響。 方法 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的A549細(xì)胞由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科細(xì)胞庫提供。A549細(xì)胞在含10%滅活小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 1沉默NF-κB/p65對TNF-α誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡水平的影響 A549細(xì)胞分為5組：空白對照組(不加干預(yù)因素)、TNF-α組(僅用TNF-α刺激)p65siRNA組(預(yù)轉(zhuǎn)染p65siRNA且用TNF-α刺激)、siRNA陰性對照組(預(yù)轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA且用TNF-α刺激)、siRNA陽性對照組(預(yù)轉(zhuǎn)染陽性對照siRNA且用TNF-α刺激)。進(jìn)行TNF-α(10ng/mL)刺激前6小時(shí)預(yù)轉(zhuǎn)染siRNA,傾去轉(zhuǎn)染液后開始以TNF-α刺激24小時(shí)。 以RT-PCR法檢測NF-κB/p65mRNA的表達(dá)水平；免疫印跡法分別檢測胞漿和胞核中NF-κB/p65蛋白的表達(dá)水平；ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10的濃度；MTT法檢測細(xì)胞存活率；Annexin V/PI法檢測細(xì)胞凋亡率。 2沉默NF-κB/p65對TNF-α誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 細(xì)胞分組同上。以DCFH-DA探針法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；比色法檢測細(xì)胞的丙二醛濃度、總抗氧化能力、總超氧化物歧化酶活力、總谷胱甘肽的濃度。 3沉默NF-κB/p65對TNF-α誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮NOX/DUOX家族的影響細(xì)胞分組同上。Real-time RT-PCR檢測NOX/DUOX家族各基因mRNA表達(dá)水平；免疫印跡法檢測NOX1、NOX2、NOX4蛋白的表達(dá)水平。 4轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞NOX1基因調(diào)控機(jī)制的探討 Alibaba2.1軟件預(yù)測NOX1近端啟動(dòng)子區(qū)的NF-κB結(jié)合元件,據(jù)此設(shè)計(jì)并合成DNA探針；EMSA法檢測上述探針與核蛋白中NF-κB是否結(jié)合；在此基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建含目的NOX1啟動(dòng)子片段(1415bp)的重組pGL3螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-NOX1-1415、缺失上述NF-κB陽性結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子片段(1327bp)所對應(yīng)的重組pGL3螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-NOX1-1327(缺失載體)；將pGL3-NOX1-1415、pGL3-NOX1-1327分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞,同時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pRL-TK作為內(nèi)對照,TNF-α刺激24小時(shí),雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的螢光素酶活性。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。采用單因素方差分析進(jìn)行組間均數(shù)比較,滿足方差齊性的多重比較采用LSD法,不滿足方差齊性的多重比較采用Dunnett's T3法。顯著性水準(zhǔn)α取0.05,雙側(cè)。 結(jié)果 1沉默NF-κB/p65對TNF-α誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡水平的影響 1.1各組A549細(xì)胞NF-KB/p65mRNA表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=771.003,P0.001)。 TNF-α組的A549細(xì)胞NF-KB/p65mRNA表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)(P0.05); NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞NF-κB/p65mRNA表達(dá)水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組下調(diào)(P0.05)。 1.2各組A549細(xì)胞胞漿中NF-KB/p65蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=231.811,JP0.001)。NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞胞漿中NF-KB/p65蛋白表達(dá)水平較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組下調(diào)(P0.05)。 1.3各組A549細(xì)胞胞核中NF-κB/p65蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1206.566, P0.001), TNF-α組的A549細(xì)胞胞核中NF-KB/p65蛋白表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)(P0.05)。 NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞胞核中NF-KB/p65蛋白表達(dá)水平較TNF-α組、陰性對照組、陽性對照組下調(diào)(P0.05)。 1.4各組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10的濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。TNF-α組的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中上述細(xì)胞因子濃度較空白對照組上調(diào)(P0.05)；NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中上述細(xì)胞因子濃度較TNF-α組、陰性對照組、陽性對照組下調(diào)(P0.05)。 1.5各組A549細(xì)胞存活率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.145,P0.001)。TNF-α組的A549細(xì)胞存活率較空白對照組下調(diào)(P0.05); NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞存活率較TNF-α組、陰性對照組、陽性對照組上調(diào)(P0.05)；較空白對照組下調(diào)(P0.05)。 1.6各組A549細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=155.592, P0.001)。 TNF-α組的A549細(xì)胞凋亡率較空白對照組上調(diào)(P0.05); NF-KB/p65siRNA組的A549細(xì)胞凋亡率較TNF-α組、陰性對照組、陽性對照組下調(diào)(P0.05)；較空白對照組上調(diào)(P0.05)。 2沉默NF-KB/p65對TNF-α誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 2.1各組A549細(xì)胞活性氧、丙二醛的濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。TNF-α組的A549細(xì)胞活性氧、丙二醛的濃度較空白對照組上調(diào)(P0.05)；NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞活性氧、丙二醛的濃度較TNF-α組、陰性對照組、陽性對照組下調(diào)(P0.05)。 2.2各組A549細(xì)胞總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、總谷胱甘肽的濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。TNF-α組的A549細(xì)胞的上述指標(biāo)較空白對照組下調(diào)(P0.05)；NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞的上述指標(biāo)較TNF-α組、陰性對照組、陽性對照組上調(diào)(P0.05)。 3沉默NF-κB/p65對TNF-α誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮NOX/DUOX家族的影響 3.1各組A549細(xì)胞NOX1、NOX2、NOX4mRNA表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；TNF-α組的A549細(xì)胞上述基因mRNA表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)(P0.05)。 NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞上述基因mRNA表達(dá)水平較TNF-α組、陰性對照組下調(diào)(P0.05)。 3.2各組A549細(xì)胞NOX3、NOX5、DUOX1、DUOX2mRNA的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3.3各組A549細(xì)胞NOX1、NOX2、NOX4蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；TNF-α組的A549細(xì)胞上述蛋白的表達(dá)水平較空白對照組上調(diào)(P0.05); NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平較TNF-α組、陰性對照組下調(diào)(P0.05)。 4轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞NOX1基因調(diào)控機(jī)制的探討 4.1Alibaba2.1軟件分析結(jié)果提示,NOX1近端啟動(dòng)子區(qū)約1500bp范圍內(nèi)可預(yù)測到2個(gè)NF-κB結(jié)合元件。元件1稱為NOX1/kB1,位于-1095-1086,序列為5'-CAGGAAAAC-3';元件2稱為NOX1/κB2:位于-261-252,序列為5'-TAAAATCCCC-3'。 4.2經(jīng)EMSA檢測,元件2可與核蛋白中NF-KB/p65結(jié)合。 4.3載體pGL3-NO1-1415、載體pGL3-NOX1-1327經(jīng)雙酶切電泳及測序鑒定,結(jié)構(gòu)正確。 4.4轉(zhuǎn)染載體pGL3-NOX1-1415的各組A549細(xì)胞螢光素酶活性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142.105,P0.001)。TNF-α組的A549細(xì)胞螢光素酶活性較空白對照組上調(diào)(P0.05); NF-κB/p65siRNA組的A549細(xì)胞螢光素酶活性較TNF-α組、陰性對照組下調(diào)(P0.05)；較空白對照組上調(diào)(P0.05)。4.5分別轉(zhuǎn)染pGL3空質(zhì)粒、載體pGL3-NOX1-1415、載體pGL3-NOX1-1327后,經(jīng)TNF-α刺激的各組A549細(xì)胞螢光素酶活性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=646.047,P0.001)。轉(zhuǎn)染載體pGL3-NOX1-1415、pGL3-NOX1-1327的A549細(xì)胞螢光素酶活性較轉(zhuǎn)染pGL3者上調(diào)(P0.05)；轉(zhuǎn)染pGL3-NOX1-1415較pGL3-NOX1一1327,A549細(xì)胞螢光素酶活性升高(P0.05)。 結(jié)論 1.TNF-α誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549能夠在體外模擬ALI肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞的炎癥——氧化損傷及細(xì)胞凋亡； 2.NF-κB/p65參與TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥-氧化損傷的病理生理過程,RNA干擾技術(shù)可有效沉默NF-κB/p65并下調(diào)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激程度,減少細(xì)胞凋亡,達(dá)到保護(hù)結(jié)構(gòu)細(xì)胞的目的。 3.NOX/DUOX家族中NOX1、NOX2、NOX4等亞型參與了TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥-氧化損傷的病理生理過程； 4.NF-κB/p65通過與NOXl啟動(dòng)子區(qū)κB結(jié)合元件(-261--252bp)結(jié)合,調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過程；NOX1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)的完整性影響NF-κB/p65的結(jié)合及調(diào)控作用。 綜上所述,在TNF-α誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549產(chǎn)生的炎癥—氧化應(yīng)激環(huán)路中,NF-κB/p65可通過與NOX1啟動(dòng)子區(qū)KB結(jié)合元件(-261--252bp)結(jié)合實(shí)現(xiàn)對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔣靜靜,杜立中;肺泡上皮II型細(xì)胞的免疫學(xué)相關(guān)因素[J];國外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊);2005年03期

2 ;N-acetylcysteine inhibits activation of toll-like receptor 2 and 4 gene expression in the liver and lung after partial hepatic ischemia-reperfusion injury in mice[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2007年03期

3 陳業(yè)民;黃文杰;李勝利;梁坤;;重癥肺炎大鼠干擾素-γ、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α含量變化[J];中國病理生理雜志;2007年03期

4 羅顯榮,伍偉玲,王琳,葉小群,張丹;急性呼吸窘迫綜合征患者血清和支氣管肺泡灌洗液中白介素-1β的變化[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);2003年06期

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本文編號：2404313