【摘要】：目的:觀察過表達Derlin-1的RLE-6TN細胞經(jīng)香煙煙霧提取物(cigarette smoke extrac,CSE)不同時間處理后的凋亡率的變化。探索其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡(Endoplasmic reticulum stress induced apoptosis,ERSIA)的關(guān)系。方法:攜帶Derlin-1編碼序列的慢病毒轉(zhuǎn)染RLE-6TN細胞過表達Derlin-1基因;轉(zhuǎn)染空白慢病毒作為對照組;制備CSE;用10%CSE處理對照組、過表達組細胞0h、3h、6h、12h、24h;流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率;Western blot技術(shù)檢測各組細胞Derlin-1、IRE1、p-IRE1、JNK、P-JNK,CHOP、caspase12蛋白的表達;Realtime-PCR技術(shù)檢測各組細胞Derlin-1m RNA的表達。結(jié)果:1.慢病毒過表達Derlin-1穩(wěn)定株的檢測:Western blot檢測過表達組Derlin-1蛋白的表達較對照組增加,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。Realtime-PCR檢測Derlin-1m RNA的表達結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。2.流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡:用10%CSE處理對照組、過表達組細胞0h,3h,6h,12h,24h后收集細胞,用Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒處理后在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。對照組及過表達組凋亡率隨著處理時間延長而增加,每組各時間點之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。過表達組凋亡率較對照組均明顯降低,同一時間點的兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.Derlin-1在各組細胞中的表達:Western blot結(jié)果顯示對照組Derlin-1的表達隨CSE處理時間的延長呈逐漸增加的趨勢,且組與組之間差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。在過表達組,Derlin-1的表達同樣呈現(xiàn)出隨時間延長的增長趨勢,各組間的兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(p0.05)。但每組較對照組表達量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。Realtime-PCR檢測兩組Derlin-1m RNA的表達結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。4.Derlin-1對ERS通路的影響:Western blot結(jié)果顯示在對照組及過表達組中總的IRE1的表達在各時間點的變化不大,差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05)。兩組的p-IRE1均有隨處理時間的延長呈現(xiàn)增加趨勢,每組各時間點的比較具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。但過表達組的p-IRE1的表達量較對照組有所下降,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)5.Derlin-1對ERSIA通路的影響:Western blot結(jié)果顯示在對照組和過表達組中總JNK的表達量在各時間點的表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。p-JNK與CHOP的表達量在兩組中均有逐漸增加的趨勢,呈時間依賴性,每組各時間點兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。兩種蛋白過表達組較對照組表達量均下降,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。caspase12的表達量在對照組從3h升高,12h達高峰,24h有所下降,但仍高于0h組,各時間點的兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。在過表達組中,caspase12的表達隨時間的延長而增加,但各時間點表達量較對照組均下降,且差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論:CSE誘導(dǎo)RLE-6TN細胞發(fā)生ERS,促進ERSIA的發(fā)生。Derlin-1的上調(diào)可以緩解ERS,保護細胞免于凋亡。
[Abstract]:Aim: to observe the changes of apoptosis rate of RLE-6TN cells which expressed Derlin-1 after treated with cigarette smoke extract (cigarette smoke extrac,CSE) at different time. To explore the relationship between endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis (Endoplasmic reticulum stress induced apoptosis,ERSIA). Methods: lentivirus carrying Derlin-1 coding sequence was transfected into RLE-6TN cells to overexpression Derlin-1 gene, blank lentivirus was transfected as control group, and CSE; was treated with 10%CSE for 24 h. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells in each group. The expression of Derlin-1,IRE1,p-IRE1,JNK,P-JNK,CHOP,caspase12 protein was detected by; Western blot and the expression of Derlin-1m RNA was detected by Realtime-PCR technique. Results: 1. Detection of lentivirus overexpression Derlin-1 stable strain the expression of Derlin-1 protein in: Western blot overexpression group was significantly higher than that in control group (p0.05). The expression of Derlin-1m RNA by Realtime-PCR was consistent with that of Western blot. 2. Flow cytometry was used to detect apoptosis: the control group was treated with 10%CSE, and the cells in the overexpression group were collected after 24 hours after 0 h, 3 h, 6 h and 12 h. Apoptosis rate was detected by flow cytometry after treated with Annexin V-APC/7-AAD cell apoptosis detection kit. The apoptotic rate of the control group and the overexpression group increased with the prolongation of the treatment time, and there were significant differences between the two groups at each time point (p0.05). The rate of apoptosis in overexpression group was significantly lower than that in control group. There were significant differences between the two groups at the same time point (p0.05). The expression of: Western blot in the cells of each group showed that the expression of Derlin-1 in the control group increased gradually with the prolongation of the time of CSE treatment. The difference between the two groups was statistically significant (p 0.05). In the overexpression group, the expression of Derlin-1 also showed an increasing trend with time, and there was statistical difference between the two groups (p0. 05). However, the expression of protein in each group was significantly higher than that in the control group. The difference was statistically significant (p0.05). The expression of Derlin-1m RNA in the two groups by Realtime-PCR was consistent with that of Western blot. The effect of 4.Derlin-1 on the ERS pathway was found in the control group and the overexpression group. The expression of IRE1 changed little at different time points. The difference was not statistically significant (p0.05). The p-IRE1 of both groups showed an increasing trend with the prolongation of treatment time, and the comparison of each time point in each group was statistically significant (p0. 05). However, the expression of p-IRE1 in the overexpression group was lower than that in the control group. The difference was statistically significant (p0.05) the effect of 5.Derlin-1 on the ERSIA pathway. The results of: Western blot showed that the expression of total JNK in control group and overexpression group had no significant change at each time point. There was no significant difference (p0.05). The expression of p-JNK and CHOP increased gradually in both groups in a time-dependent manner, and the differences were statistically significant at each time point (p0.05). The expression of caspase12 increased from 3 h to 12 h, peaked at 12 h, decreased at 24 h, but still higher than that in 0 h group. There was significant difference between the two groups at each time point (p 0.05). In the overexpression group, the expression of caspase12 increased with the prolongation of time, but the expression of caspase12 at each time point was lower than that of the control group, and the difference was statistically significant (p0.05). Conclusion: CSE induces the occurrence of ERS, in RLE-6TN cells, and the up-regulation of Derlin-1 can alleviate the apoptosis of ERS,.
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R56

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本文編號：2379175