【摘要】：【目的】優(yōu)化穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)細菌宏基因組DNA的提取方法,以便于高效提取微量的細菌DNA進行后續(xù)的PCR反應(yīng)和測序�！痉椒ā咳》�(wěn)定期COPD患者的BALF 5mL,離心收集細胞。為了有效提取樣品中革蘭氏陽性菌的基因組,對QIAGEN的DNA提取試劑盒的操作步驟進行優(yōu)化:加入裂解緩沖液ATL后首先運用研磨珠和多功能生物樣品勻質(zhì)器破碎菌壁,再加入蛋白酶K孵育,然后加入裂解緩沖液AL振蕩混勻。無水乙醇沉淀DNA后,將全部溶液過柱,用洗液AW1和AW2各洗柱一次,最后加50μL洗脫液洗脫DNA。提取的DNA定量后,運用PCR方法檢測樣本中的細菌16S rDNA量,并按照測序要求構(gòu)建DNA文庫進一步驗證。【結(jié)果】試劑盒優(yōu)化法提取的BALF的DNA總量為467.5(135.0-1697.5)ng,明顯高于按照傳統(tǒng)酚-氯仿法提取的DNA總量95.0(0-612.5)ng,并且所提取的DNA可以很好的擴增細菌的16S rDNA以及構(gòu)建DNA文庫,改良后的擴增產(chǎn)物明顯增多(P=0.002)�！窘Y(jié)論】使用DNA提取試劑盒結(jié)合研磨珠和多功能生物樣品勻質(zhì)器破菌壁的方法能夠更高效的提取BALF中微量的宏基因組DNA,為進一步的測序和菌群分析打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:[objective] to optimize the extraction method of bacterial macro genomic DNA from bronchoalveolar lavage fluid (bronchoalveolar lavage fluids,BALF) from patients with stable chronic obstructive pulmonary disease (chronic obstructive pulmonary diseases,COPD). It was convenient to extract microamounts of bacterial DNA for subsequent PCR reaction and sequencing. [methods] the BALF 5mL of stable COPD patients was collected and the cells were collected by centrifugation. In order to extract the genome of Gram-positive bacteria from the sample effectively, the operating procedure of DNA extraction kit of QIAGEN was optimized. After adding ATL, the bacteria wall was first broken by grinding beads and multifunctional biological sample homogenizer. After incubation with protease K, AL was added to the lytic buffer. After precipitating DNA with anhydrous ethanol, the solution was crossed over the column, then washed with AW1 and AW2, and then the DNA. was eluted with 50 渭 L eluant. After quantifying the extracted DNA, the amount of 16s rDNA in the sample was detected by PCR method, and the DNA library was constructed according to the requirements of sequencing. [results] the total DNA of BALF extracted by the optimization method of the kit was 467.5 (135.0-1697.5) ng,. The total amount of DNA extracted by traditional phenol-chloroform method was 95.0 (0-612.5) ng, and the extracted DNA could amplify 16s rDNA of bacteria and construct DNA library. (P0. 002). [conclusion] the method of DNA extraction kit combined with grinding beads and multifunctional biological sample homogenizer can be used to extract microamounts of macro genomic DNA, from BALF more efficiently. It will lay a foundation for further sequencing and microflora analysis.
【作者單位】： 北京大學(xué)第三醫(yī)院呼吸科;北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部-密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與臨床研究聯(lián)合研究所;密西根大學(xué)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部-密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與臨床研究聯(lián)合研究所,轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)-密西根項目(BMU20110176)~~
【分類號】：R563.9

【共引文獻】

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本文編號：2378629