【摘要】：背景：支氣管哮喘是一種由多種細胞及細胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病,其病因復(fù)雜,發(fā)病機制至今尚未完全清楚,涉及到免疫學、神經(jīng)內(nèi)分泌學、遺傳、環(huán)境等多種因素。氣道炎癥,氣道高反應(yīng)性,氣道重塑是其三個基本特征。目前有關(guān)Ras通路與哮喘的關(guān)系的研究逐漸成為熱點。Ras作為細胞生長分化的主要調(diào)節(jié)者,在細胞外刺激產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于中樞地位。已有研究顯示Ras介導(dǎo)的各下游信號傳導(dǎo)通路在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)中均發(fā)揮重要作用。研究Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有助于尋求新的藥物作用靶點。 Ras信號傳導(dǎo)通路主要由以下幾條途徑組成：1.絲裂原活化蛋白激酶信號通路(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)。Ras-MAPK通路是目前最為明確的信號通路。細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal regulated kinase ERK)是MAPK信號通路下游家族成員之一,參與調(diào)控細胞有絲分裂,與細胞的增殖分化遷移密切相關(guān)。2.磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信號通路(Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-protein kinase B (AKT))。在調(diào)節(jié)細胞代謝、凋亡、增殖和分化方面與Ras-MAPK途徑同等重要。在腫瘤發(fā)生過程中起重要的輔助作用,介導(dǎo)氣道炎性疾病嗜酸細胞的分化、降解、聚集及粘附分子的表達。3. GalGEF信號通路。使細胞免于凋亡,并加速細胞周期進程和細胞生長。4.其他。如Rac和Rho信號通路、Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子(RasGRP)信號通路、NF-kappB信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路等。 Ras傳導(dǎo)通路與很多疾病(包括支氣管哮喘、腫瘤等)的發(fā)生發(fā)展均有密切的關(guān)系。已經(jīng)證實：基于ras信號通路為靶標的抗腫瘤治療方法,在治療由ras突變所導(dǎo)致的腫瘤中具有重要的價值。目前針對Ras信號途徑的藥物研究主要有以下幾類：(1)法尼基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(Farnesyltransferase inhibitors, FTIs)。法呢基轉(zhuǎn)移酶(Farnesyltransferase, FTIase)是Ras蛋白加工過程中最重要的催化酶之一。Ras蛋白翻譯后的修飾過程主要包括三個步驟：Ras蛋白羧基末端半胱氨酸(Cys)殘基的法呢酯化,經(jīng)法呢酯化的Cys殘基的甲基化,以及清除羧基末端的氨基酸殘基。其中羧基端的法尼基化是ras蛋白定位于細胞膜內(nèi)側(cè)進而發(fā)揮效能的關(guān)鍵修飾步驟。因此,抑制ras蛋白翻譯后羧基端的法尼基化是抑制ras信號通路的一種重要治療手段。(2)抗Ras的反義寡核苷酸。根據(jù)Ras蛋白和mRNA序列設(shè)計反義RNA,通過堿基互補配對的方式,抑制、破壞目的基因,以下調(diào)Ras的表達。(3)抑制ras的下游靶點。通過反義核苷酸技術(shù)合成的小分子化合物能特異抑制Ras及下游靶點RafmRNA的表達,下調(diào)ERK活性。(4)抑制Ras的上游靶點。Ras蛋白上游信號通路的異�；罨嗫杉せ頡as。小分子酪氨酸激酶抑制劑和針對細胞外受體區(qū)域的抗體,通過阻斷生長因子受體酪氨酸激酶的活性,從而抑制Ras的活化。(5)恢復(fù)Ras蛋白GTP酶的活性。Ras突變導(dǎo)致GTP酶失活,已研制的GTP類似物可代替GAP,更有效的水解Ras蛋白。(6)其他。包括以Ras通路為靶標的基因治療、免疫治療,以及以Ras外周成分為靶標的或以與Ras信號通路明顯相關(guān)的其他信號通路為靶標的治療方法等。目前,基于ras信號通路為靶標的治療策略,在人類腫瘤的治療中顯示了廣闊的前景。 但Ras抑制劑對支氣管哮喘的干預(yù)作用及其機制尚罕見報道。反式法呢基硫代水楊酸(Trans-farnesyl thiosalicylic acid, FTS)是一種新型的Ras抑制劑,FTS對結(jié)合活化GTP的Ras具有明顯的選擇性,在動物模型中無明顯毒性或不良副作用。 目的：本研究建立小鼠哮喘模型,著重研究FTS對哮喘小鼠氣道炎癥,氣道重塑和Th細胞分化的影響,進一步探討Ras通路與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以及FTS作為Ras抑制劑,對支氣管哮喘的干預(yù)機制,為哮喘的治療提供新的思路。 方法：6-8周級BALB/c小鼠60只,隨機法分成六組,每組10只。正常對照組、哮喘模型組、地塞米松治療組、5FTS干預(yù)組(5mg/kg)、10FTS干預(yù)組10mg/kg)、15FTS干預(yù)組(15mg/kg)。 1.制作哮喘小鼠模型：于實驗第1d、第14d致敏,即卵白蛋白(OVA)40μg由1mg氫氧化鋁乳化,總體積200μ1,腹腔注射。第21-27d,將小鼠置于密閉容器內(nèi),以超聲霧化器霧化,3%OVA鹽水氣溶膠吸入激發(fā),每天1次,每次30min。 2.藥物干預(yù)：地塞米松治療組,于每次激發(fā)前1小時腹腔注射2mg/kg地塞米松；FTS干預(yù)組,于每次激發(fā)前1小時分別腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg FTS。 3.收集實驗標本：支氣管肺泡灌洗液,血清,肺組織、脾組織。 4.檢測實驗指標 4.1小鼠左肺組織HE染色,觀察組織形態(tài)學變化。 4.2檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞數(shù)。 4.3酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清中IL-5濃度。 4.4免疫印跡法(Western Blot)檢測小鼠右肺組織pan-ras, ERK蛋白表達水平,脾組織GATA-3蛋白表達水平。 4.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative PCR, QPCR):檢測小鼠右肺組織MMP-2、MMP-9mRNA表達,脾組織Foxp3, GATA-3mRNA表達。 結(jié)果： 1)肺組織形態(tài)學：正常對照組小鼠可見支氣管壁光滑,上皮細胞完整,肺泡及支氣管周圍未見炎性細胞浸潤,肺泡黏膜無腫脹。哮喘模型組小鼠,肺泡及支氣管周圍見可見明顯炎性細胞浸潤,支氣管上皮水腫,氣道周圍小血管充血明顯。地塞米松及FTS干預(yù)組,可見支氣管及肺泡周圍少量炎性細胞浸潤,支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)基本正常,炎癥及充血不同程度的減輕。 2)小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥細胞計數(shù)、血清IL-5濃度在各組間均有顯著性差異(BALF細胞總數(shù)F=52.27,嗜酸細胞數(shù)F=67.61,血清IL-5濃度F=23.57,P值均為0.00)。哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)、嗜酸細胞數(shù)及血清IL-5濃度均較正常組增高(P0.05),地塞米松及FTS干預(yù)組各指標均低于未干預(yù)組(P0.05),且隨著FTS濃度的增加,各指標下降更明顯。1OFTS及15FTS組與地塞米松組相比,有更顯著地療效。但1OFTS組與15FTS組間差異無顯著性。 3)小鼠肺pan-ras蛋白的表達均值在各組間有顯著性差異(F=153.55,P=0.00)。哮喘組小鼠肺組織中pan-Ras的蛋白表達均較正常對照組增高(P0.05),地塞米松及FTS干預(yù)組較未干預(yù)組表達減少(P0.05),與地塞米松治療組相比,FTS的下調(diào)作用更為明顯,但無濃度依賴性。 4)小鼠脾GATA-3蛋白及GATA-3mRNA的表達均值在各組間均有顯著性差異(GATA-3蛋白F=106.44, P=0.00; GATA-3mRNA F=6.02, P=0.00)。哮喘組脾組織GATA-3mRNA和GATA-3蛋白的表達較正常對照組均有增加(P0.05),地塞米松及FTS干預(yù)組較未干預(yù)組表達減少(P0.05),減少程度與FTS濃度無關(guān)。對GATA-3mRNA的表達,FTS各組療效與地塞米松相當。對GATA-3蛋白表達,地塞米松組和FTS各相比差異顯著(P0.05),提示FTS對脾GATA-3蛋白表達的抑制作用大于地塞米松組。 5)小鼠脾Foxp3mRNA的表達均值在各組間有顯著性差異(F=2.85,P=0.029)。哮喘組小鼠脾組織中Foxp3mRNA表達較正常對照組減少(P0.05)。FTS干預(yù)后,表達水平較未干預(yù)組增高(P0.05),且與濃度無關(guān)。地塞米松干預(yù)后雖有升高趨勢,但與未干預(yù)組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6)小鼠肺ERK1/2蛋白的表達均值在各組間有顯著性差異(F=92.34,P=0.00)。哮喘組小鼠肺組織ERKl/2的蛋白表達較正常對照組增高(P0.05),干預(yù)后,表達水平較未干預(yù)組減少(P0.05),減少程度與FTS濃度無關(guān)。地塞米松組與FTS組各相比差異顯著(P0.05),提示FTS的作用強于地塞米松。 7)小鼠肺MMP-2、MMP-9mRNA的表達均值在各組間有顯著性差異(MMP-2F=4.51, P=0.003; MMP-9F=4.68, P=0.002)。哮喘小鼠肺組織MMP-2、MMP-9表達較正常對照組增高(P0.05),干預(yù)后,表達水平較未干預(yù)組減少(P0.05),減少程度與FTS劑量無關(guān)。地塞米松組和FTS各組相比療效無顯著差異(P0.05)。 結(jié)論：本文從免疫機制、神經(jīng)內(nèi)分泌機制等角度探討了Ras通路與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。通過抑制Ras信號通路可以減輕支氣管哮喘小鼠的氣道炎癥及氣道重塑,為哮喘的治療開拓了新的思路。本研究中,FTS作為Ras抑制劑,與糖皮質(zhì)激素一樣,能明顯改善哮喘模型小鼠氣道炎癥細胞浸潤、減少細胞因子IL-5的分泌,下調(diào)肺組織pan-ras、ERK1/2蛋白及MMP-9、MMP-2mRNA表達水平,下調(diào)脾組織GATA-3mRNA、GATA-3蛋白表達水平,上調(diào)脾組織Foxp3mRNA表達水平。減輕哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑,促進TH1/TH2細胞平衡的恢復(fù),增加Treg的數(shù)量及其抑制功能。其機制可能是通過抑制不同的Ras下游級聯(lián)反應(yīng)通路,從而調(diào)節(jié)復(fù)雜的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程,最終發(fā)揮治療哮喘的作用。但哮喘的發(fā)病機制極為復(fù)雜,Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑亦是一個復(fù)雜的相互交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò),且與其他的信號系統(tǒng)相互聯(lián)系。本研究亦發(fā)現(xiàn)FTS與地塞米松的治療效應(yīng)并不完全一致,可能二者通過影響不同的信號通路機制起效。總之,在治療支氣管哮喘方面,FTS的作用機制仍未完全清晰,尚需進一步更深入的研究。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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本文編號：2374850