本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2調(diào)控肺部炎癥和細菌清除的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《浙江大學》 2015年

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2調(diào)控肺部炎癥和細菌清除的機制研究

趙麗芳  

【摘要】：研究背景和研究目的： 慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的可以預防和治療的常見呼吸系統(tǒng)疾病,其氣流受限多呈進行性發(fā)展,引起COPD急性加重的主要原因是下呼吸道反復感染,其中流感嗜血桿菌是COPD急性加重的主要病原菌之一。不可分型流感嗜血桿菌是多形的G-桿菌,是上呼吸道常見的定植菌。NTHi侵入下呼吸道后會損害氣道黏膜纖毛清除能力,造成氣道粘液分泌增加和上皮受損。這些病理改變可以加速細菌在呼吸道的定植和感染,造成肺實質(zhì)損傷和進行性小氣道阻塞,從而促進COPD的發(fā)生發(fā)展。 巨噬細胞在病原微生物與衰老細胞的清除、促進炎癥反應、誘發(fā)適應性免疫反應及損傷組織的重構(gòu)與修復過程中起著關(guān)鍵作用。巨噬細胞在不同微環(huán)境的作用下可分為兩種類型：M1和M2型。M1型巨噬細胞分泌大量的炎癥因子,并能夠高效遞呈抗原,激活Thl細胞反應,具有抗病原微生物和腫瘤細胞的作用。M2型巨噬細胞殺菌能力比較弱,具有抑制Thl細胞免疫反應,促進損傷組織修復、重構(gòu)和血管生長的功能。然而COPD患者中肺泡巨噬細胞吞噬細菌以及分泌細胞因子的功能都受到嚴重紊亂,清除細菌能力受損。因此闡明NTHi感染后肺部炎癥反應和細菌清除的細胞和分子機制,將為NTHi感染相關(guān)疾病預防和控制、臨床治療策略等提供新的思路,也可為新型藥物研制提供分子靶標。 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(Src homology phosphotyrosyl phosphatase2)是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTP)家族成員之一,由PTPN11基因編碼并在人類細胞和組織中廣泛表達,參與調(diào)控多種胞內(nèi)轉(zhuǎn)導信號通路。而且SHP2與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系密切,參與調(diào)控多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。然而,目前SHP2基因?qū)Ψ尾考毦腥竞蠹毙匝装Y的影響及其相關(guān)分子調(diào)控機制仍未得到深入的闡明。因此,我們將通過建立骨髓來源巨噬細胞和髓系細胞SHP2基因定向敲除小鼠NTHi感染模型,探索SHP2基因及其相關(guān)信號通路在巨噬細胞炎癥反應和細菌清除中的作用。我們的研究有助于闡明SHP2在調(diào)控巨噬細胞分化以及增強機體抗菌免疫的分子機制,為肺部細菌感染的免疫學治療提供新的策略。 研究方法 體內(nèi)試驗 1.建立急性肺NTHi感染模型：C57/BL6小鼠通過氣道滴注NTHi (1×107CFU/40μL)的方法建立肺部感染模型,分別于NTHi感染6h,12h,24h收集肺組織檢測IL-6,TNF-a等炎癥因子的表達,同時檢測SHP2的表達情況。C57/BL6小鼠在NTHi感染前30分鐘腹腔注射SHP2特異性抑制劑PHPS1(3mg/kg),感染結(jié)束后肺組織做病理學檢查鏡下觀察PHPS1處理后小鼠炎癥反應的變化,同時收集小鼠肺組織抽提RNA檢測炎癥介質(zhì)的表達,收集肺泡灌洗液檢測炎癥因子水平,明確PHPS1對NTHi所致肺部炎癥反應的影響。 2.構(gòu)建髓系細胞SHP2基因敲除鼠動物感染模型：使用Cre-loxP技術(shù)實現(xiàn)髓系細胞SHP2基因定向敲除,SHP2flox/flox小鼠與LysMcre+小鼠交配后可以得到髓系細胞定向敲除SHP2小鼠SHP2Δ/Δ(基因表型LysMcre+/SHP2flox/flox),同時得到的LysMcr+和SHP2flox/flox小鼠作為同窩對照小鼠,氣道滴注NTHi (1×107CFU/40μL)后,肺組織病理切片觀察肺組織炎性反應。收集肺組織檢測細菌負荷及炎性介質(zhì)的變化。 體外實驗 1.提取C57/BL6小鼠的骨髓來源的巨噬細胞(BMDM):小鼠骨髓細胞體外經(jīng)C-MSF誘導分化為BMDM細胞,NTHi感染后檢測細胞SHP2的表達情況。PHPS1預處理BMDM后,加入NTHi刺激,檢測巨噬細胞表型變化,巨噬細胞吞噬作用及其殺菌作用。觀察PHPS1對巨噬細胞功能的影響。分離LysMcre+/SHP2flox/flox來源的BMDM,檢測NTHi感染后巨噬細胞表型變化,明確SHP2在巨噬細胞分化中的作用。 2. NTHi刺激髓系細胞敲除SHP2鼠來源的BMDM后,檢測STAT1,STAT6, AKT, p65磷酸化水平,闡明SHP2參與巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化的信號通路。 結(jié)果 1. NTHi感染C57/BL6小鼠12h后,SHP2基因表達的升高,TNF-a,IL-6,MIP-2等炎癥介質(zhì)表達水平顯著增高,肺部病理切片顯示肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞,肺泡間隔微血管充血水腫,并伴有大量炎性細胞浸潤。 2.抑制SHP2可以有效減弱NTHi誘導的肺部炎癥反應。小鼠腹腔注射PHPS1可以抑制肺組織產(chǎn)生IL-6,TNF-a炎癥因子,減少肺組織炎癥細胞浸潤。 3.C57BL/6小鼠BMDM感染NTHi后,SHP2基因水平和蛋白水平表達均有顯著升高。PHPS1抑制SHP2后,可以抑制NTHi感染后M1型巨噬細胞的分化,同時促進NTHi感染后M2型巨噬細胞表面標記物YM-1,ARG的表達。并且PHPS1削弱了巨噬細胞的殺菌能力。 4.SHP2敲除鼠SHP2Δ/Δ感染NTHi后,肺組織炎性細胞浸潤減少,肺組織和肺泡灌洗液中細菌負荷升高,SHP2Δ/Δ來源的巨噬細胞感染NTHi后,巨噬細胞M1標記物表達降低,而細胞M2標記物YM-1表達增高。 5.敲除BMDM中的SHP2基因,顯著下調(diào)NTHi誘導的p-65NF-κB磷酸化。提示SHP2可能通過調(diào)節(jié)p-65磷酸化活性,來調(diào)節(jié)NF-κB信號通路,從而抑制了細菌誘導的巨噬細胞炎癥反應。 結(jié)論 研究發(fā)現(xiàn)SHP2參與調(diào)控了NTHi誘導的肺部炎癥反應和肺部細菌清除。SHP2可能通過調(diào)節(jié)P65-NF-KB信號通路調(diào)控巨噬細胞炎癥反應。抑制SHP2可以減弱M1型巨噬細胞的分化,削弱巨噬細胞殺菌功能。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563.9
【目錄】：

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