【摘要】：研究目的1、明確博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠及體外II型肺泡上皮細(xì)胞(MLE-12)EMT模型中Tribbles Homologue 3(TRB3)的表達(dá)及Smad信號(hào)通路的活化情況。2、探討TRB3過表達(dá)及低表達(dá)時(shí)對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響及體外對(duì)TGF-β刺激的MLE-12細(xì)胞EMT的影響。3、探討TRB3過表達(dá)及低表達(dá)對(duì)肺纖維化體內(nèi)及體外模型中Smad信號(hào)通路的影響,初步揭示TRB3表達(dá)變化通過Smad依賴信號(hào)通路對(duì)肺纖維化的影響。研究方法1、構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白(Greenfluorescenceprotein,GFP)示蹤基因的Ad-TRB3,Ad-TRB3-sh RNA載體,并進(jìn)行鑒定及擴(kuò)增。2、實(shí)驗(yàn)分組處理1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中將MLE-12細(xì)胞分為8組,未進(jìn)行TGFβ刺激組:空白對(duì)照組,Ad-GFP感染組,Ad-TRB3感染組,Ad-sh RNA-TRB3感染組;進(jìn)行TGFβ刺激組:TGFβ1組,TGFβ1+Ad-GFP感染組,TGFβ1+Ad-TRB3感染組,TGFβ1+Ad-sh RNA-TRB3感染組。2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中將C57BL/6小鼠分為5組:單純對(duì)照組+生理鹽水,纖維化模型組+生理鹽水,纖維化+Ad-GFP組,纖維化+Ad-TRB3組,纖維化+Ad-TRB3-sh RNA組,采用博萊霉素氣管內(nèi)滴注的方法建立肺纖維化模型,分別于D7、D14和D28時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)大鼠一批,收集BALF、肺組織標(biāo)本供實(shí)驗(yàn)用。3、CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MLE-12細(xì)胞的增殖率、凋亡率。4、HE染色、Masson染色、羥脯氨酸測(cè)定、Ashcroft纖維化評(píng)分及肺泡灌洗液細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)研究博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠不同時(shí)間段肺部炎癥及纖維化程度。5、PCR檢測(cè)各組TRB3、α-SMA、Colla I m RNA的表達(dá)。6、Western blot檢測(cè)各組TRB3、α-SMA、E-cadherin、Vimentin,p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)。7、ELISA檢測(cè)Colla I的表達(dá)。研究結(jié)果1、博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠及體外TGF-β刺激誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞EMT模型中TRB3 m RNA及蛋白含量均升高。2、博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠及體外TGF-β刺激誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞EMT模型中p-Smad2、p-Smad3蛋白均升高;TRB3過表達(dá)促進(jìn)了p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá),TRB3低表達(dá)降低了p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)。3、TRB3過表達(dá)促進(jìn)了博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠及體外MLE-12細(xì)胞EMT的發(fā)生:E-cadherin表達(dá)降低,α-SMA、Colla I m RNA及α-SMA、Vimentin、Colla I蛋白表達(dá)均升高,TRB3低表達(dá)則作用相反。4、TRB3過表達(dá)促進(jìn)了博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠發(fā)生肺纖維化,TRB3低表達(dá)減弱了博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠發(fā)生肺纖維化。5、(1)未進(jìn)行TGF-β刺激的MLE-12細(xì)胞,TRB3過表達(dá)時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,抑制了其增殖,TRB3低表達(dá)時(shí)促進(jìn)了MLE-12細(xì)胞增殖,抑制了其凋亡;(2)TGF-β刺激MLE-12細(xì)胞后,細(xì)胞增殖受抑制,凋亡增加,說明TGF-β誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞發(fā)生凋亡;(3)TRB3過表達(dá)促進(jìn)了TGF-β對(duì)MLE-12細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及對(duì)細(xì)胞增殖的抑制,TRB3低表達(dá)則抑制了TGF-β對(duì)MLE-12細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo),促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。研究結(jié)論1、博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠及體外MLE-12細(xì)胞EMT模型中表達(dá)TRB3。2、博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠及體外MLE-12細(xì)胞EMT模型中Smad信號(hào)通路得到活化。3、TRB3表達(dá)可能通過Smad依賴的信號(hào)通路影響博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠及體外MLE-12細(xì)胞EMT的發(fā)生,進(jìn)而影響肺纖維的形成與發(fā)展。4、TRB3表達(dá)可能通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡影響EMT及肺纖維化的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2359009