【摘要】：目的:氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性是支氣管哮喘的兩個(gè)關(guān)鍵的病理生理特征。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)支氣管哮喘具有有效的治療作用。因而本研究通過(guò)分離、培養(yǎng)并鑒定小鼠肺間充質(zhì)干細(xì)胞(LR-MSCs),并探討尾靜脈注射LR-MSCs對(duì)哮喘模型小鼠氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的影響及哮喘治療的新途徑。方法:采用流式細(xì)胞分選儀從經(jīng)過(guò)酶混合體消化的小鼠肺組織單細(xì)胞懸液中分選Sca-1+CD31-CD45-細(xì)胞群(即LR-MSCs)后進(jìn)行體外培養(yǎng),再將穩(wěn)定傳代的LR-MSCs通過(guò)流式細(xì)胞表面分析檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的鑒定;采用腹腔注射和反復(fù)霧化吸入雞卵清白蛋白OVA的方法建立急性哮喘模型、同時(shí)利用NS建立正常對(duì)照組、并通過(guò)尾靜脈注射LR-MSCs入哮喘模型小鼠體內(nèi)建立LR-MSCs干預(yù)組、NS處理小鼠尾靜脈注射LR-MSCs建立LR-MSCs對(duì)照組;利用BUXCO無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)儀測(cè)定各組小鼠氣道高反應(yīng)性的Penh值;通過(guò)支氣管肺泡灌洗術(shù)獲得支氣管肺泡灌洗液BALF,計(jì)數(shù)各組小鼠BALF的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)以及單核細(xì)胞數(shù);測(cè)定各組小鼠BALF中Th2型炎癥因子IL4、IL-5、IL-13的表達(dá);通過(guò)ELISA測(cè)定各組小鼠血清中炎癥因子OVAsIgE以及OVAsIgG1的水平;HE染色觀察大體組織改變及炎性浸潤(rùn)程度。結(jié)果:(1)成功分離Sca-1+CD31-CD45-細(xì)胞群然后對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng),并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sca-1+CD31-CD45-細(xì)胞群表面間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá),驗(yàn)證了Sca-1+CD31-CD45-細(xì)胞群即LR-MSCs,該細(xì)胞群陽(yáng)性表達(dá)CD29、Sca-1,陰性表達(dá)CD31和CD45,符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)情況;(2)成功通過(guò)OVA致敏及激發(fā)建立急性哮喘小鼠模型,表現(xiàn)為哮喘模型組的氣道高反應(yīng)性Penh值明顯高于正常對(duì)照組,BALF中Th2型炎癥因子IL4、IL-5、IL-13的水平,BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)以及單核細(xì)胞計(jì)數(shù),血清中炎癥因子OVAsIgE以及OVAsIgG1的水平明顯高于正常對(duì)照組,且哮喘模型組較正常對(duì)照組支氣管壁及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);(3)通過(guò)尾靜脈注射LR-MSCs進(jìn)行干預(yù)可有效降低氣道高反應(yīng)性并減輕氣道炎癥水平,表現(xiàn)為L(zhǎng)R-MSCs干預(yù)組的氣道高反應(yīng)性Penh值較哮喘模型組明顯下降,LR-MSCs干預(yù)組BALF中Th2型炎癥因子IL4、IL-5、IL-13的水平,BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)以及單核細(xì)胞計(jì)數(shù),血清炎癥因子中OVAs IgE以及OVAs IgG1水平明顯低于哮喘模型組,且LR-MSCs干預(yù)組較哮喘模型組支氣管壁及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯,而正常對(duì)照組與LR-MSCs對(duì)照組之間氣道高反應(yīng)性與氣道炎癥水平無(wú)明顯差異。結(jié)論:(1)成功分離獲得肺間充質(zhì)干細(xì)胞LR-MSCs,提示小鼠肺內(nèi)存在LR-MSCs。(2)LR-MSCs干預(yù)能在一定程度上減輕哮喘小鼠氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性,可望成為治療哮喘的新途徑,具有廣闊應(yīng)用前景。
[Abstract]:Objective: airway inflammation and airway hyperresponsiveness are two key pathophysiological features of bronchial asthma. Previous studies have found that mesenchymal stem cells have an effective therapeutic effect on bronchial asthma. In this study, we isolated, cultured and identified mouse pulmonary mesenchymal stem cells (LR-MSCs), and explored the effects of tail vein injection of LR-MSCs on airway inflammation and airway hyperresponsiveness in asthmatic mice and a new approach to the treatment of asthma. Methods: Sca-1 CD31-CD45- cell group (LR-MSCs) was isolated from mouse lung tissue single cell suspension digested by enzyme mixture by flow cytometry and cultured in vitro. The stable passage of LR-MSCs was detected by flow cytometry and the surface markers of mesenchymal stem cells were identified. The acute asthma model was established by intraperitoneal injection and repeated atomization inhalation of chicken ovalbumin OVA, and the normal control group was established by NS, and the LR-MSCs intervention group was established by tail vein injection of LR-MSCs into the asthmatic model mice. LR-MSCs was injected into tail vein of mice treated with NS to establish LR-MSCs control group. The airway hyperresponsiveness (Penh) of mice in each group was measured by BUXCO noninvasive pulmonary function detector. The BALF, count of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was obtained by bronchoalveolar lavage. The total number of BALF cells, the number of neutrophils, the number of eosinophilic granulocytes and the number of monocytes in each group; The expression of Th2 type inflammatory factor (IL4,IL-5,IL-13) in BALF of each group was determined; the levels of OVAsIgE and OVAsIgG1 in serum of each group were measured by ELISA; the changes of gross tissue and the degree of inflammatory infiltration were observed by HE staining. Results: (1) Sca-1 CD31-CD45- cells were isolated and cultured in vitro, and the expression of surface markers of mesenchymal stem cells (MSCs) on the surface of Sca-1 CD31-CD45- cells was detected by flow cytometry. The positive expression of CD29,Sca-1, and CD45, in Sca-1 CD31-CD45- cell group, that is, LR-MSCs, were consistent with the expression of surface markers of mesenchymal stem cells. (2) the acute asthma model was successfully established by OVA sensitization and stimulation. The results showed that the airway hyperreactive Penh value in the asthma model group was significantly higher than that in the normal control group, and the level of Th2 type inflammatory factor IL4,IL-5,IL-13 in BALF was significantly higher than that in the normal control group. The levels of total cell count, neutrophil count, eosinophilic granulocyte count, monocyte count, serum inflammatory factor OVAsIgE and OVAsIgG1 in BALF were significantly higher than those in the control group. Compared with the normal control group, a large number of inflammatory cells infiltrated the bronchial wall and blood vessels in the asthmatic model group. (3) injection of LR-MSCs via caudal vein could effectively reduce airway hyperresponsiveness and reduce airway inflammation, which showed that the Penh value of airway hyperresponsiveness in LR-MSCs intervention group was significantly lower than that in asthmatic model group. The levels of Th2 type inflammatory factor IL4,IL-5,IL-13 in BALF, the total number of cells in BALF, neutrophil count, eosinophil count and monocyte count in LR-MSCs intervention group. The levels of OVAs IgE and OVAs IgG1 in serum inflammatory factors were significantly lower than those in asthmatic model group, and the infiltration of inflammatory cells in bronchial wall and blood vessel in LR-MSCs intervention group was less than that in asthma model group. There was no significant difference in airway hyperresponsiveness and airway inflammation between normal control group and LR-MSCs control group. Conclusion: (1) the successful isolation of lung mesenchymal stem cells (LR-MSCs,) suggests that the presence of LR-MSCs. (2) LR-MSCs can alleviate airway inflammation and airway hyperresponsiveness in asthmatic mice to some extent. It is expected to be a new approach to the treatment of asthma and has broad application prospects.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R562.25

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本文編號(hào)：2350883