本文關鍵詞：RNAi沉默NF-kB p65對小鼠巨噬細胞表達細胞因子的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學》 2009年

RNAi沉默NF-kB p65對小鼠巨噬細胞表達細胞因子的影響

石榴  

【摘要】： 研究背景和目的 肺炎是呼吸系統(tǒng)常見疾病,重癥肺炎(severe community-acquired pneumonia,SCAP)因其療效差,病情發(fā)展迅猛,易引發(fā)全身炎癥反應綜合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MultipleSystem Organ dysfunction,MODS)等嚴重并發(fā)癥甚至造成人員死亡,成為威脅人類健康的一大問題。引起SCAP的原因很多,發(fā)病機制復雜,一般由嚴重的細菌或/和病毒感染所致。在感染或非感染因素作用下,肺內(nèi)的炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等活化后產(chǎn)生內(nèi)源或外源性炎性物質如細胞因子、凝血和纖溶物質、血管活性肽、黏附因子、遲發(fā)性炎性物質如高遷移率蛋白分子等引起炎癥反應,發(fā)揮機體的防御作用。既往認為,重癥肺炎造成病情加重、多組織器官出現(xiàn)損傷及功能不全是病原體或毒素直接作用的結果�，F(xiàn)階段看法不盡然,大量研究表明,初始炎癥信號經(jīng)過活化擴大后,上述的內(nèi)、外源性炎癥介質表達迅速上調,失控性釋放,激發(fā)連鎖“瀑布效應”(cascade effect,CE),使炎性/抗炎反應失衡,免疫功能紊亂,機體組織細胞發(fā)生凋亡及壞死,最終導致重癥肺炎及嚴重并發(fā)癥。 在上述的各種炎癥介質中,促炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡失調是感染進一步發(fā)展為SIRS及膿毒癥的關鍵。目前已知的促炎細胞因子主要有腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、白介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-8(Interleukin-8,IL-8)等,抗炎性細胞因子主要有白介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、白介素-13(Interleukin-13,IL-13)等。 TNF-a與靶細胞膜表面的TNF受體作用,激活多種信號轉導途徑、激酶和轉錄調節(jié)因子,活化細胞基因,產(chǎn)生廣泛的生物學作用。業(yè)已明確,在機體處于嚴重創(chuàng)傷感染的狀態(tài)下,腫瘤壞死因子TNF可以通過誘導次級炎性介質的釋放,引起“炎癥級聯(lián)效應”,介導機體高代謝狀態(tài),激活內(nèi)皮細胞、各臟器實質細胞凋亡通路等一系列復雜的病理生理學作用,使各系統(tǒng)臟器由細胞損傷破壞進而發(fā)展為臟器功能衰竭。TNF-a可誘發(fā)IL-1、IL-6、IL-8以及繼發(fā)性炎癥介質的產(chǎn)生,并由此進一步激發(fā)炎癥連鎖反應;同時可激活凝血及補體系統(tǒng),促進黏附分子、前列腺素E2、血小板刺激因子、糖皮質激素等強效致炎因子的釋放和表達,進一步加重肺組織損傷。TNF-a被認為是重癥肺炎發(fā)病中的重要促炎介質,在肺部炎癥中,TNF-a通過促進中性粒細胞表面細胞黏附分子CD11/18表達及自由基釋放,介導粒細胞在心肺循環(huán)中黏附于肺毛細血管內(nèi)皮上,進而損傷血管內(nèi)皮。研究發(fā)現(xiàn)TNF-a在SIRS早期普遍升高,在發(fā)生MODS時增高更為明顯,血中的TNF-a水平對判斷重癥肺炎的病情進展具有預警作用。 白細胞介素家族(interleukins,ILs)多個成員被證實與肺炎關系密切,如促炎細胞因子IL-1、IL-6及抗炎細胞因子IL-10等。IL-1是急性期免疫反應的主要調節(jié)因子,可通過刺激下丘腦前部的前列腺激動中樞而誘導典型的炎癥發(fā)熱反應,此外還可通過改變內(nèi)皮細胞中黏附分子的表達和分布而發(fā)揮重要作用。研究表明,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是單核一巨噬細胞合成分泌IL-1的強烈刺激劑。IL-6在過度炎癥反應時大量分泌,誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞及微循環(huán)的一系列炎癥改變,對血管內(nèi)皮細胞及炎癥細胞具有直接激活和毒性作用,促進肝細胞分泌急性期蛋白。目前大量研究發(fā)現(xiàn)IL-6水平增高是最早出現(xiàn)的感染指標,比常規(guī)的C.反應蛋白要提前很多,血漿高水平的IL-6與CAP和ARDS的高病死率有關。Monton等發(fā)現(xiàn),在重癥肺炎中使用糖皮質激素使IL-6下降,病死率有降低。IL-10是一個以免疫抑制為主的多向免疫調節(jié)因子,主要生物活性表現(xiàn)為直接抑制炎癥細胞的活化進而抑制細胞因子的產(chǎn)生。它能在轉錄、轉錄后兩個階段上影響前炎癥因子的水平。IL-10不僅能抑制前炎性細胞因子相應基因的轉錄而阻斷其合成,同時還能影響前炎性細胞因子mRNA的穩(wěn)定性,使得其水平下降。另外它還可以通過抑制核因子-κB(NF-κB)的激活,從而抑制內(nèi)毒素性ALI大鼠模型的肺泡巨噬細胞釋放TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8等前炎性細胞因子,減少使白細胞聚集的炎性介質和黏附分子,減輕炎癥反應。 TNF-a、IL-1、IL-6、IL-10等細胞因子在重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展的作用不可忽略。如何針對重癥肺炎時出現(xiàn)的炎性/抗炎失衡進行深入研究,尋求治療新途徑是目前人類面臨的課題,以往對細胞因子、免疫調節(jié)、抗氧化劑治療的探索火熱,特別是細胞因子拮抗劑方面的研究,部分動物實驗研究中確實有較多結果提示炎癥細胞因子有潛在的臨床應用價值,但在臨床試驗中并沒有得到類似結果。相反,還有一些使病死率增加的數(shù)據(jù),可見,炎癥反應是一個及其復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng),單純的拮抗炎癥細胞因子的治療不能取得滿意的療效。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展,利用siRNA干擾使靶基因沉默從而調節(jié)目的蛋白功能,顯示出巨大的應用潛力。NF-κB因其在炎癥反應中參與多種炎癥介質基因的轉錄和調控,引起國內(nèi)外學者的極大關注和興趣,目前在一些疾病如類風濕性關節(jié)炎的基礎研究及前期臨床研究中已經(jīng)取得一些成效。 NF-κB最初在鼠成熟B細胞和粒細胞瘤中發(fā)現(xiàn)并命名為細胞核Kappa輕鏈基因表達的調節(jié)子,后來研究發(fā)現(xiàn)其存在于多種細胞中。NF-κB通常以同源或異源二聚體p50/p65非活性形式存在于幾乎所有類型細胞的胞質,P65具有使調控基因轉錄活性增強的作用,而P50則與調控基因結合的親和力有關。在靜態(tài)細胞,p50/p65二聚體在血漿中與I-κBa、I-κBβ和I-κBγ等NF-κB抑制家族蛋白(Iκds)結合,隱藏p65與靶DNA結合的關鍵的氨基酸殘基,抑制NF-κB與靶DNA調節(jié)區(qū)的特異性結合。NF-κB在炎癥介質的過度釋放中起著關鍵作用。炎癥反應發(fā)生時,前炎性因子TNF-a,IL-1β及脂多糖(LPS)等多種因素可誘導多種細胞如人外周血單核細胞、內(nèi)皮細胞和肺組織的NF-κB的活化。IκBs的氨基末端第32,36位絲氨酸殘基從NF-κB-IκBs復合物中突起,很容易被IκBs蛋白激酶磷酸化,磷酸化的IκBs進一步被蛋白酶降解,使NF-κB從NF-κB-IκBs復合物中解離出并轉位于細胞核,與相應的靶基因結合,調節(jié)靶基因的轉錄。有報道NF-κB/Relp50和p65亞單位在體內(nèi)對抑制膿毒血癥或感染性休克時的高死亡率起著重要作用。經(jīng)NF-κB調控的基因超過150余種,與免疫細胞的活化,T、B淋巴細胞的發(fā)育,炎性反應,細胞凋亡等多種細胞活動有關,更與多種炎癥介質的相關基因的表達有關,如炎性蛋白質包括單核細胞趨化因子MCP-1,MCP-2,MCP-3;巨噬細胞炎性蛋白MIP-1a,MIP-1b,MIP-2;細胞因子TNF-a,IL-1β,IL-8;趨化因子IL-8和誘導性一氧化氮合酶iNOS;黏附因子如細胞間黏附因子(ICAM-1)、血管細胞黏附因子(VCAM-1)和E選擇素等。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象,是生物界一種古老而且進化上高度保守的基因表達調節(jié)機制。其實質是通過雙鏈RNA使目的mRNA降解,從而特異性地抑制目的蛋白表達。與常規(guī)的基因敲除、反義寡核苷酸和小分子阻斷劑相比,siRNA有明顯的優(yōu)勢:基因敲除技術雖然很有效,但需要大量的人力和財力,同時致死變異可能阻礙胚胎發(fā)育;反義寡核苷酸和小分子阻斷劑雖然簡單便宜,但穩(wěn)定性和準確性稍差;而siRNA不但有效而且特異性高,從而為研究大量基因的功能和廣泛應用提供了保證。目前NF-κB在不同疾病中的重要作用以及與之相關的治療策略成為熱點,尤其是利用siRNA技術對NF-κB相應基因的沉默來改變其對目的基因的調控以及對炎性調控機制的進一步探索,使得很多疾病有望得以控制,如移植、腫瘤、凋亡、類風濕性關節(jié)炎等方面的基礎研究已經(jīng)取得一些成效。盡管NF-κB和炎性反應關系密切,可以增強多種炎性介質如TNF-a、IL-1β、IL-8以及黏附因子的轉錄,且可被內(nèi)毒素、TNF-a、IL-1β所激活,但利用NF-κB的沉默來控制和治療肺炎方面的研究卻鮮有報道。從基因水平對肺炎進行干預在理論上是一種很有潛力的新方法。 為了研究NF-κB p65基因在炎癥中的作用和地位,本課題選擇增強型綠色熒光蛋白(EGFP)作為報告分子,利用化學合成方法合成3對針對NF-κB p65基因的siRNA,通過預實驗篩選出干擾效果最佳的NF-κB p65 mRNA的siRNA序列,在體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞株Ana-1中,擬通過RNAi技術沉默巨噬細胞NF-κB p65基因,探討對其下游多個對重癥肺炎發(fā)生發(fā)展關系密切的細胞因子表達的影響,為重癥肺炎從基因層面進行防治提供理論依據(jù)。 方法 1、設計并合成NF-kB p65 siRNA。 美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中尋找小鼠NF-kB p65的mRNA序列全長,根據(jù)文獻報道進行目標序列選取,使用BLAST將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫進行比較,排除和其他編碼序列同源的序列,確定小鼠NF-kBp65的siRNA目標基因序列。 2、細胞培養(yǎng)、瞬時轉染NF-kB p65 siRNA。 Ana-1細胞用高糖的1640培養(yǎng)基加10%小牛血清進行培養(yǎng),無需胰酶消化,直接吸管吹打即可傳代,選用指數(shù)生長期細胞六孔板鋪板。根據(jù)脂質體Lipofectamine ~(TM)2000說明書對siRNA和脂質體用量進行優(yōu)化實驗,以提高轉染效率。最終選用siRNA的濃度為50pmol,Lipofectamine ~(TM)2000體積為5ul作為每孔細胞的轉染劑量。將3對siRNA通過Lipofectamine ~(TM)2000共轉染Ana-1細胞株,通過熒光顯微鏡觀察熒光強度,挑選出轉染率最高的一對siRNA用于下一步實驗。 3、轉染24小時后,RT-PCR檢測細胞內(nèi)NF-kB p65 mRNA表達,Western blot檢測細胞內(nèi)NF-kB p65蛋白表達。 將轉染率最高的siRNA、陰性對照siRNA、陽性對照siRNA通過轉染試劑轉入Ana-1細胞株,同時設置空白對照組(即無任何siRNA組),轉染24小時后利用RT-PCR方法進行檢測各組NF-kB p65 mRNA的表達;Western blot方法檢測各組細胞內(nèi)NF-kB p65蛋白的表達。 4、LPS刺激NF-kB p65基因干擾后和未干擾的巨噬細胞Ana-1,通過ELISA方法檢測兩者細胞上清中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10含量。 培養(yǎng)Ana-1細胞至指數(shù)生長期,一組細胞經(jīng)NF-kB p65 siRNA干擾24小時后,另一組細胞未經(jīng)干擾,兩組同時予LPS刺激,通過ELISA方法檢測兩組細胞上清中與感染進展關系密切的各細胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10含量的變化。 結果 1、細胞內(nèi)NF-kB p65的變化 NF-kB p65 siRNA轉染細胞24h后,RT-PCR結果顯示:ANA-1細胞未經(jīng)LPS刺激時,沉默組與對照組相比NF-kB p65 mRNA表達顯著降低(0.483±0.085vs.0.903±0.069),具統(tǒng)計學差異(P=0.000),而陰性對照組、陽性對照組與空白組相比較,無顯著差異(P=0.712,P=0.358)。LPS刺激ANA-1細胞后,沉默組與對照組相比NF-kB p65 mRNA表達顯著降低(0.404±0.068 vs.1.067±0.064),具統(tǒng)計學差異(P=0.000),而陰性對照組、陽性對照組與空白組相比較,無顯著差異(P=0.346,P=0.361)。 NF-kB p65 siRNA轉染細胞24h后,Westem blot結果顯示:ANA-1細胞未經(jīng)LPS刺激時,沉默組與對照組相比NF-kB p65蛋白表達顯著降低(0.429±0.087vs.0.889±0.059),具統(tǒng)計學差異(p=0.000),而陰性對照組、陽性對照組與空白組相比較,無顯著差異(P=0.271,P=0.360)。LPS刺激ANA-1細胞后,沉默組與對照組相比NF-kB p65蛋白表達顯著降低(0.589±0.107 vs.1.074±0.059),具統(tǒng)計學差異(P=0.000),而陰性對照組、陽性對照組與空白組相比較,無顯著差異(P=0.523,P=0.809)。 2、Ana-1細胞NF-kB p65基因沉默后TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10動態(tài)變化TNF-a:LPS刺激后4h、12h、24h TNF-a表達量增多,較未刺激時(0h)有明顯差異(P＜0.05或P＜0.01),刺激后12h出現(xiàn)峰值,RNA干擾組TNF-a表達量相應時間點(除0h外)較對照組均有不同程度降低(P＜0.05)。IL-1β:LPS刺激后4h、12h、24h IL-1β表達量增多,較未刺激時(0h)有明顯差異(P＜0.05或P＜0.01),刺激后12h出現(xiàn)峰值,RNA干擾組IL-1β表達量相應時間點(除0h外)較對照組不同程度降低(P＜0.05)。 IL-6:LPS刺激后4h、12h、24h IL-6表達量增多,較未刺激時(0h)有顯著差異(P＜0.01),刺激后12h出現(xiàn)峰值,RNA干擾組相應時間點(除0h外)IL-6表達量較對照組均有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。 IL-10:LPS刺激后4h、12h、24h IL-10表達量增多,較未刺激時(0h)有差異(P＜0.05或P＜0.01),RNA干擾后12h、24h IL-10表達量較對照組增多(P＜0.05),其余時間點未見明顯差異。 結論 本研究發(fā)現(xiàn): 1、通過RNAi技術沉默巨噬細胞Ana-1 NF-kB p65基因,24h后用RT-PCR與Western blot方法檢測LPS刺激組與LPS未刺激組NF-kB p65的表達情況,發(fā)現(xiàn)無論LPS刺激與否,沉默組與對照組相比,NF-kB p65表達都出現(xiàn)顯著降低。即采用RNAi技術沉默Ana-1 NF-kB p65基因,24小時即可基本抑制其表達。 2、Ana-1細胞NF-kB p65基因沉默24h后給予LPS(1ug/m1)刺激,通過ELISA方法檢測不同時間點(0h、4h、12h、24h)細胞上清中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10的含量,并與未沉默組相對照,發(fā)現(xiàn)經(jīng)NF-kB p65基因沉默的Ana-1細胞受LPS刺激后促炎因子TNF-a、IL-1β、IL-6的表達明顯減少,抑炎因子IL-10的表達增多。 3、NF-kB p65對早期炎癥細胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10的表達具有調控作用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R563.1;R459.7
【目錄】：

摘要3-10

ABSTRACT10-15

導論15-25

第一章 RNAi技術沉默小鼠巨噬細胞NF-kB p65基因25-44

引言25-26

材料與方法26-38

結果38-42

小結42-44

第二章 沉默NF-kB p65基因巨噬細胞刺激后TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達變化44-60

引言44-45

材料與方法45-48

結果48-55

小結55-56

討論56-60

參考文獻60-64

中英文縮略語詞表64-65

攻讀碩士學位期間成果65-66

致謝66-67

統(tǒng)計學審稿證明67-68

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4 龐勇;李雁;鄒卓成;林軍;何列濤;劉運珠;;益腎調督針法對腦梗塞恢復期細胞因子的影響[A];泛中醫(yī)論壇·思考中醫(yī)2006——經(jīng)典中醫(yī)的特色和優(yōu)勢論文集[C];2006年

5 張理濤;于廣新;張玉環(huán);盧桂玲;;�；撬釋こＰ糟y屑病患者外周血單一核細胞產(chǎn)生細胞因子的影響[A];中華中醫(yī)藥學會皮膚科分會第四次學術年會;全國中醫(yī)、中西醫(yī)結合皮膚病診療新進展高級研修班論文集[C];2007年

6 張玉敏;石新鋼;郭麗;段志文;馬明月;裴秀叢;;DEHP對原代淋巴細胞Th1/Th2平衡的影響[A];中國環(huán)境誘變劑學會第14屆學術交流會議論文集[C];2009年

7 吳稚冰;許亞萍;馬勝林;吳偉;馮建國;姜初明;樓中平;;旋轉磁場對大鼠放射性食管炎的防治[A];2009年浙江省放射腫瘤治療學學術年會論文匯編[C];2009年

8 丁進;馮媛;朱平;;強直性脊柱炎患者單核/巨噬細胞分泌的細胞因子的研究[A];全國臨床免疫檢驗研討會暨第六屆全國臨床免疫學術會議論文匯編[C];2009年

9 張玉環(huán);廉信;邢艷玲;劉艷華;;雷公藤多苷對變應性接觸性皮炎患者細胞因子表達影響的研究[A];中華醫(yī)學會2009年全國變態(tài)反應學術會議論文匯編[C];2009年

10 孫華;趙慧;張捷;包飛;魏鏡;王道海;張云祥;;電針百會、足三里對抑郁癥患者血清中炎性細胞因子水平的影響[A];中國針灸學會2009學術年會論文集（下集）[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳一福;[N];中國醫(yī)藥報;2005年

2 趙喜明;[N];中國醫(yī)藥報;2004年

3 楊慎峭 劉旭光 余曙光;[N];中國醫(yī)藥報;2005年

4 許沈華;[N];家庭醫(yī)生報;2007年

5 新言;[N];科技日報;2005年

6 陳金偉;[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 科文;[N];中國醫(yī)藥報;2006年

8 正;[N];中國高新技術產(chǎn)業(yè)導報;2001年

9 曹陽;[N];健康報;2007年

10 肖鑫;[N];健康報;2001年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 宋春輝;模擬HCV HVR1免疫7肽對人不同免疫細胞分泌細胞因子影響的初步研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2008年

2 戴鐘銓;模擬失重條件下骨相關細胞因子對前成骨細胞的調控作用研究[D];第四軍醫(yī)大學;2011年

3 劉占國;應用全血細胞因子譜評估腎移植受者免疫狀態(tài)[D];南方醫(yī)科大學;2010年

4 敬曉棋;乳腺炎細胞因子及T淋巴細胞亞群研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2013年

5 呂瓊霞;運輸應激對豬免疫機能的影響及其調控機理初探[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2009年

6 林云斌;昆母湯對RA滑膜成纖維細胞增殖及細胞因子表達的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學;2013年

7 郭慧;Toll樣受體介導角膜真菌感染炎癥反應的作用及基因沉寂治療研究[D];山東大學;2010年

8 姜春來;細胞因子對HIV-1疫苗DNA prime/MVA boost的加強作用[D];吉林大學;2005年

9 熊日波;維生素對類風濕關節(jié)炎大鼠血清瘦素和其他細胞因子的影響及其作用機制[D];南方醫(yī)科大學;2013年

10 張曉紅;T-依賴性B淋巴細胞激活機制的探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1993年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 何懿;人全血細胞因子在免疫抑制狀態(tài)評估中的應用[D];南方醫(yī)科大學;2010年

2 劉珠果;豬卵母細胞孤雌激活、胚胎培養(yǎng)和成熟過程中細胞因子作用的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2005年

3 邢愛紅;胰炎靈顆粒劑對重癥急性胰腺炎大鼠體內(nèi)炎性介質影響觀察[D];山東中醫(yī)藥大學;2003年

4 王延春;扶正平消湯聯(lián)合化療對惡性腫瘤病人免疫功能影響的研究[D];山東中醫(yī)藥大學;2005年

5 曹廣生;中藥復方消瘤平的抗腫瘤作用研究[D];山東大學;2005年

6 趙雷;人高遷移率族蛋白1的克隆、表達及其功能研究[D];第一軍醫(yī)大學;2005年

7 衛(wèi)榮;維醫(yī)沙療對實驗性兔膝骨關節(jié)炎的作用機制[D];新疆醫(yī)科大學;2005年

8 唐玉紅;小鼠白介素12質粒對哮喘模型CD4～+CD25～+T細胞及其相關細胞因子的影響[D];浙江大學;2006年

9 郭廣宏;應用生物芯片技術對不同人群血清細胞因子臨床意義的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

10 萬鈞;中藥（強脊1號）對活動期強直性脊柱炎作用的臨床研究[D];中國中醫(yī)科學院;2006年

  本文關鍵詞：RNAi沉默NF-kB p65對小鼠巨噬細胞表達細胞因子的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：235075