【摘要】：目的:測定脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)下大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中micro RNA-146a表達(dá)水平的動態(tài)變化;通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法檢測外源性高表達(dá)micro RNA-146a是否可通過靶向TLR4信號通路調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)下PASMCs的合成分泌細(xì)胞因子。方法:第一部分:1、以氣道內(nèi)注入LPS疊加香煙煙霧暴露法建立COPD大鼠模型,進(jìn)一步分離、培養(yǎng)原代COPD大鼠PASMCs,將第4、5代PASMCs用于后續(xù)研究;2、將PASMCs分為兩組:(1)正常組:不做任何處理;(2)LPS誘導(dǎo)組:加入配制好的LPS,使其終濃度為1μg/ml;各組細(xì)胞分別培養(yǎng)12小時(shí)(12 h)、24小時(shí)(24 h)、48小時(shí)(48 h)、72小時(shí)(72 h),收集細(xì)胞提取總RNA,Real-time PCR法檢測各組細(xì)胞中micro RNA-146a表達(dá)。第二部分:通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法將外源性micro RNA-146a導(dǎo)入PASMCs,Real-time PCR檢測micro RNA-146a轉(zhuǎn)染率,證實(shí)最佳轉(zhuǎn)染濃度及時(shí)間。設(shè)立實(shí)驗(yàn)分組:(1)正常組:未做任何處理;(2)LPS誘導(dǎo)組:加入配制好的LPS,終濃度為1μg/ml;(3)micro RNA-146a組:轉(zhuǎn)染micro RNA-146a質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基;(4)LPS+micro RNA-146a錯(cuò)義鏈組:轉(zhuǎn)染micro RNA-146a錯(cuò)義鏈質(zhì)粒,6小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基,加入LPS(終濃度1μg/ml);(5)LPS+lipofectamine2000組:給予相同劑量PBS及l(fā)ipofectamine 2000并加入LPS(終濃度1μg/ml);(6)LPS+micro RNA-146a組:轉(zhuǎn)染micro RNA-146a質(zhì)粒,6小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基,加入LPS(終濃度1μg/ml);(7)micro RNA-146a錯(cuò)義鏈組:轉(zhuǎn)染micro RNA-146a錯(cuò)義鏈質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基;(8)lipofectamine2000組:給予相同劑量PBS及l(fā)ipofectamine2000培養(yǎng)。收集各組細(xì)胞及細(xì)胞的培養(yǎng)上清液:Western Blot法檢測各組細(xì)胞中TLR4、IRAK-1、IKK、IκB、NF-κB的蛋白表達(dá);ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中γ-干擾素(IFN-γ)、血小板衍生生長因子-AB(PDGF-AB)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的含量;并將LPS+micro RNA-146a組中各蛋白的表達(dá)水平與IFN-γ、PDGF-AB、IL-6的分泌量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:第一部分:與正常組相比,LPS誘導(dǎo)下PASMCs中micro RNA-146a表達(dá)量有遞增趨勢,自培養(yǎng)12小時(shí)開始升高,72小時(shí)可維持在較高水平(P0.01);第二部分:1、通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法,證實(shí)當(dāng)質(zhì)粒與lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染比例為1:2,轉(zhuǎn)染至48小時(shí),PASMCs中micro RNA-146a的表達(dá)量最高,其表達(dá)量約為正常組的18倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);以此濃度配比及轉(zhuǎn)染時(shí)間為最佳濃度及時(shí)間進(jìn)行外源性micro RNA-146a的PASMCs內(nèi)轉(zhuǎn)染。2、micro RNA-146a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并予LPS誘導(dǎo)PASMCs,培養(yǎng)48小時(shí);結(jié)果顯示:(1)與正常組相比,LPS誘導(dǎo)后各組(LPS組、LPS+micro RNA-146a錯(cuò)義鏈組及LPS+lipofectamine2000組)細(xì)胞內(nèi)TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的NF-κB(P65)蛋白表達(dá)水平明顯增加(P0.01);而LPS+micro RNA-146a組分別與相同條件下LPS誘導(dǎo)組(LPS組、LPS+micro RNA-146a錯(cuò)義鏈組及LPS+lipofectamine2000組)比較,TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的P65蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.05)。(2)與正常組相比,LPS誘導(dǎo)組(LPS組、LPS+micro RNA-146a錯(cuò)義鏈組及LPS+lipofectamine2000組)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、PDGF-AB、IL-6分泌量明顯增加(P0.01);而轉(zhuǎn)染外源性micro RNA-146a后,可見micro RNA-146a+LPS組分別與LPS組、LPS+micro RNA-146a錯(cuò)義鏈組及LPS+lipofectamine2000組相比,其細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、PDGF-AB分泌量明顯降低(P0.01),IL-6的分泌量沒有降低,而是與LPS誘導(dǎo)組一樣呈明顯升高趨勢(P0.01)。(3)將LPS+micro RNA-146a組中各蛋白表達(dá)量與其細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子含量進(jìn)行相關(guān)性分析,可見TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的P65蛋白表達(dá)量與細(xì)胞上清液中IFN-γ、PDGF-AB含量呈正相關(guān),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而細(xì)胞上清液中IL-6的分泌量除了只與磷酸化的IKK蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)外(P0.05),與其他蛋白的表達(dá)量無明顯相關(guān)性。結(jié)論:1、LPS能誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞中micro RNA-146a的表達(dá)上調(diào),于72小時(shí)維持在較高水平;2外源性micro RNA-146a可負(fù)性調(diào)節(jié)TLR4信號通路中相關(guān)分子的蛋白表達(dá),進(jìn)而通過TLR4-IRAK-IKK-IκB-NF-κB信號通路下調(diào)肺動脈平滑肌細(xì)胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB,但I(xiàn)L-6水平不降反有升高,其原因還待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2344312