發(fā)布時間：2018-11-20 07:52

【摘要】：目的:測定脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導下大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中micro RNA-146a表達水平的動態(tài)變化;通過質粒轉染的方法檢測外源性高表達micro RNA-146a是否可通過靶向TLR4信號通路調節(jié)LPS誘導下PASMCs的合成分泌細胞因子。方法:第一部分:1、以氣道內注入LPS疊加香煙煙霧暴露法建立COPD大鼠模型,進一步分離、培養(yǎng)原代COPD大鼠PASMCs,將第4、5代PASMCs用于后續(xù)研究;2、將PASMCs分為兩組:(1)正常組:不做任何處理;(2)LPS誘導組:加入配制好的LPS,使其終濃度為1μg/ml;各組細胞分別培養(yǎng)12小時(12 h)、24小時(24 h)、48小時(48 h)、72小時(72 h),收集細胞提取總RNA,Real-time PCR法檢測各組細胞中micro RNA-146a表達。第二部分:通過質粒轉染的方法將外源性micro RNA-146a導入PASMCs,Real-time PCR檢測micro RNA-146a轉染率,證實最佳轉染濃度及時間。設立實驗分組:(1)正常組:未做任何處理;(2)LPS誘導組:加入配制好的LPS,終濃度為1μg/ml;(3)micro RNA-146a組:轉染micro RNA-146a質粒,轉染6小時后換成完全培養(yǎng)基;(4)LPS+micro RNA-146a錯義鏈組:轉染micro RNA-146a錯義鏈質粒,6小時后換成完全培養(yǎng)基,加入LPS(終濃度1μg/ml);(5)LPS+lipofectamine2000組:給予相同劑量PBS及l(fā)ipofectamine 2000并加入LPS(終濃度1μg/ml);(6)LPS+micro RNA-146a組:轉染micro RNA-146a質粒,6小時后換成完全培養(yǎng)基,加入LPS(終濃度1μg/ml);(7)micro RNA-146a錯義鏈組:轉染micro RNA-146a錯義鏈質粒,轉染6小時后換成完全培養(yǎng)基;(8)lipofectamine2000組:給予相同劑量PBS及l(fā)ipofectamine2000培養(yǎng)。收集各組細胞及細胞的培養(yǎng)上清液:Western Blot法檢測各組細胞中TLR4、IRAK-1、IKK、IκB、NF-κB的蛋白表達;ELISA檢測各組細胞上清液中γ-干擾素(IFN-γ)、血小板衍生生長因子-AB(PDGF-AB)、白細胞介素-6(IL-6)的含量;并將LPS+micro RNA-146a組中各蛋白的表達水平與IFN-γ、PDGF-AB、IL-6的分泌量進行相關性分析。結果:第一部分:與正常組相比,LPS誘導下PASMCs中micro RNA-146a表達量有遞增趨勢,自培養(yǎng)12小時開始升高,72小時可維持在較高水平(P0.01);第二部分:1、通過質粒轉染法,證實當質粒與lipofectamine2000的轉染比例為1:2,轉染至48小時,PASMCs中micro RNA-146a的表達量最高,其表達量約為正常組的18倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);以此濃度配比及轉染時間為最佳濃度及時間進行外源性micro RNA-146a的PASMCs內轉染。2、micro RNA-146a質粒轉染并予LPS誘導PASMCs,培養(yǎng)48小時;結果顯示:(1)與正常組相比,LPS誘導后各組(LPS組、LPS+micro RNA-146a錯義鏈組及LPS+lipofectamine2000組)細胞內TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的NF-κB(P65)蛋白表達水平明顯增加(P0.01);而LPS+micro RNA-146a組分別與相同條件下LPS誘導組(LPS組、LPS+micro RNA-146a錯義鏈組及LPS+lipofectamine2000組)比較,TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的P65蛋白表達水平明顯下調(P0.05)。(2)與正常組相比,LPS誘導組(LPS組、LPS+micro RNA-146a錯義鏈組及LPS+lipofectamine2000組)細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、PDGF-AB、IL-6分泌量明顯增加(P0.01);而轉染外源性micro RNA-146a后,可見micro RNA-146a+LPS組分別與LPS組、LPS+micro RNA-146a錯義鏈組及LPS+lipofectamine2000組相比,其細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、PDGF-AB分泌量明顯降低(P0.01),IL-6的分泌量沒有降低,而是與LPS誘導組一樣呈明顯升高趨勢(P0.01)。(3)將LPS+micro RNA-146a組中各蛋白表達量與其細胞上清液中細胞因子含量進行相關性分析,可見TLR4、磷酸化的IRAK-1、磷酸化的IKK、磷酸化的IκB、磷酸化的P65蛋白表達量與細胞上清液中IFN-γ、PDGF-AB含量呈正相關,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而細胞上清液中IL-6的分泌量除了只與磷酸化的IKK蛋白表達量呈負相關外(P0.05),與其他蛋白的表達量無明顯相關性。結論:1、LPS能誘導肺動脈平滑肌細胞中micro RNA-146a的表達上調,于72小時維持在較高水平;2外源性micro RNA-146a可負性調節(jié)TLR4信號通路中相關分子的蛋白表達,進而通過TLR4-IRAK-IKK-IκB-NF-κB信號通路下調肺動脈平滑肌細胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB,但IL-6水平不降反有升高,其原因還待進一步研究。
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【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R563.9

【參考文獻】

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1 王鵬雁;蔣明;韓旭惠;王昌明;楊丹;;TLR-4信號通路對COPD大鼠肺動脈平滑肌細胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB的影響[J];實用醫(yī)學雜志;2016年20期

2 周秀梅;陳龍;邵一葉;陳英輝;施曉紅;;microRNA-146a在LPS誘導的大鼠雪旺細胞損傷模型中的表達[J];中國臨床醫(yī)學;2015年03期

3 談春江;杜娟;;慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期基質金屬蛋白酶-9和γ-干擾素與肺功能的相關性[J];貴陽醫(yī)學院學報;2015年02期

4 聶成;劉芬;曾振國;詹以安;鄧文剛;卿城;邵強;丁成志;揭克敏;錢克儉;;轉染miR-146a對肺泡巨噬細胞中核因子-κB表達的影響[J];廣東醫(yī)學;2014年18期

5 廖運學;王昌明;蔣明;馬禮兵;徐青;陳峰;呂倩;;大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞原代培養(yǎng)及其生物學特性和功能的研究[J];中國全科醫(yī)學;2014年27期

6 胡瑞成,戴愛國,譚雙香;缺氧性肺動脈高壓發(fā)病中肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡變化[J];南華大學學報(醫(yī)學版);2001年05期

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本文編號：2344312