【摘要】：目的肺微血管通透性增加及隨之而來的肺間質(zhì)和肺泡水腫是ARDS的重要病理特征。血管內(nèi)皮通透性包括跨細胞通透性和細胞旁通透性兩個方面。生理狀態(tài)下,內(nèi)皮細胞間連接會限制血液中生物大分子如白蛋白的通過,血管內(nèi)皮對白蛋白的基礎(chǔ)通透性主要取決于caveolae介導(dǎo)的跨細胞轉(zhuǎn)運。也有研究表明,caveolae介導(dǎo)的白蛋白跨細胞轉(zhuǎn)運不僅在生理狀態(tài)下對維持正常組織膠體滲透壓起決定性作用,而且也參與炎癥刺激(如活化的中性粒細胞等)導(dǎo)致的肺微血管通透性增加,此過程中可觀察到Cav-1磷酸化和caveolae增加。嚴重感染時,細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞通透性增加,目前已知的機制有LPS激活部分細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,破壞細胞間連接從而增加細胞旁通透性。關(guān)于在LPS致肺微血管內(nèi)皮細胞通透性增加過程中,跨細胞通透性如何變化及期間小窩蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)和caveolae所起作用尚未見報道。Visfatin又稱內(nèi)脂素,是一種主要來源于內(nèi)臟脂肪的新型脂肪細胞因子,具有多種生物學(xué)功能,除降低血糖、誘導(dǎo)脂肪細胞分化等效應(yīng)外,還可促進細胞釋放炎癥介質(zhì),進而參與體內(nèi)炎癥反應(yīng),并引起血管內(nèi)皮功能紊亂。另有報道visfatin可誘導(dǎo)細胞膜上“脂筏”聚集,通過促進氧化應(yīng)激反應(yīng)等使單層內(nèi)皮細胞的通透性增加,而caveolae正是“脂筏”中最主要的一種類型。臨床資料也顯示visfatin可能參與ARDS的發(fā)生發(fā)展,但其對肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)的直接損傷效應(yīng)及作用機制是否與Cav-1有關(guān),目前尚未見報道。本課題擬檢測LPS對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs)白蛋白內(nèi)吞和跨細胞轉(zhuǎn)運的影響,探討其中Cav-1和caveolae所起的作用;再就visfatin對RPMVECs損傷與否及相關(guān)可能機制進行初步研究。方法本研究體外培養(yǎng)RPMVECs并鑒定,經(jīng)胰酶消化傳代,取2-6代細胞進行實驗;先給予細胞LPS刺激,利用A488標記白蛋白檢測細胞白蛋白內(nèi)吞,將RPMVECs接種于Transwell,用伊文思藍標記白蛋白(evans blue bound to BSA,EBA)檢測大分子物質(zhì)跨細胞轉(zhuǎn)運,電阻抗儀測定跨內(nèi)皮細胞電阻值(transendothelial electrical resistance,TER)反映細胞旁通透性,同時Western blot法檢測Cav-1磷酸化及轉(zhuǎn)位,并用激光共聚焦顯微鏡觀察Cav-1表達定位;然后給予PP2或甲基β環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin,MβCD)預(yù)處理以抑制Src激酶活性或破壞caveolae結(jié)構(gòu),相同方法檢測預(yù)處理對LPS所致上述效應(yīng)的影響;另外分別用visfatin、LPS或visfatin+LPS刺激RPMVECs,Western blot法了解PKC活化及Cav-1、ERM磷酸化程度,檢測EBA透過細胞單層及TER的變化,并用FITC-鬼筆環(huán)肽經(jīng)熒光顯微鏡觀察細胞肌動蛋白骨架;再用TER反映PKC抑制劑—BIM對visfatin致細胞通透性變化的影響。結(jié)果1.體外成功分離培養(yǎng)RPMVECs,并經(jīng)形態(tài)學(xué)、CD34和FITC-異植物凝集素(FITC-BSI)結(jié)合實驗證實。2.10μg/ml LPS刺激RPMVECs,Cav-1第14位酪氨酸殘基的磷酸化自刺激后5min開始升高,30min達高峰,60min時有所下降,但仍高于基礎(chǔ)值,于相同時相點檢測總Cav-1,未見其蛋白含量變化。3.10μg/ml LPS刺激RPMVECs,western blot法測得Cav-1自Triton可溶區(qū)域向Triton不可溶區(qū)域的轉(zhuǎn)位(translocation)自刺激后5min開始增加,15min時達高峰,之后逐漸下降但仍持續(xù)至60min以后,同時激光共聚焦顯微鏡下可見LPS刺激15min時Cav-1明顯自胞膜向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移。4.10μg/ml LPS刺激RPMVECs 15min,鏡下見RPMVECs對A488標記白蛋白的內(nèi)吞增加,相同時相點EBA經(jīng)Transwell中細胞單層的通透性開始增加,但此時TER尚未見明顯變化,繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)TER自LPS刺激30min才開始降低。5.15μmol/L PP2預(yù)處理RPMVECs可明顯減少LPS誘導(dǎo)的Cav-1磷酸化(P0.05),15μmol/L PP2或2.0mmol/L MβCD預(yù)處理均可使LPS誘導(dǎo)的Cav-1轉(zhuǎn)位減少(P0.05)。6.15μmol/L PP2或2.0mmol/L MβCD預(yù)處理RPMVECs明顯抑制LPS誘導(dǎo)的A488標記白蛋白內(nèi)吞增加,減少LPS刺激15min時EBA的通透性。7.0.5μg/ml visfatin單獨刺激RPMVECs15min并不能使EBA經(jīng)細胞單層的通透性增加,但加重此時LPS致白蛋白跨細胞通透性增加的程度。8.0.5μg/ml visfatin單獨刺激RPMVECs,自刺激30min后TER開始下降,至少持續(xù)至180min,同時可觀察到細胞F-actin骨架排列紊亂,與10μg/ml LPS引起RPMVECs的TER及F-actin骨架變化類似但程度較輕,而visfatin+LPS共同作用的損傷效應(yīng)更加顯著。9.0.5μg/ml visfatin刺激RPMVECs 30min時,western blot法顯示細胞PKC被激活轉(zhuǎn)位,同時Cav-1和ERM磷酸化水平增加。10.1μmol/L BIM預(yù)處理RPMVECs可明顯減輕visfatin引起的單層細胞TER降低的程度。結(jié)論1.LPS呈時間依賴性增加RPMVECs上Cav-1的磷酸化,并促使Cav-1表達轉(zhuǎn)位。2.LPS誘導(dǎo)的Cav-1磷酸化部分受Src激酶調(diào)控,抑制Src激酶或破壞cavelae結(jié)構(gòu)均可抑制Cav-1轉(zhuǎn)位。3.LPS刺激RPMVECs,細胞內(nèi)吞白蛋白和跨細胞轉(zhuǎn)運的增加先于細胞旁通透性的增加,Cav-1的磷酸化和表達轉(zhuǎn)位是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。4.visfatin單獨刺激RPMVECs并不能引起與LPS類似的白蛋白跨細胞通透性增加,但可使細胞骨架排列紊亂,細胞間隙加大,細胞旁通透性增加,并能夠與LPS協(xié)同作用,加重損傷。5.visfatin增加RPMVECs單層細胞通透性依賴于PKC途徑的激活,并與Cav-1和ERM磷酸化有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563.8

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 崔浩;試論中藥成份對眼部屏障的通透性[J];黑龍江醫(yī)學(xué);2005年01期

2 長瀨光昌;薛同一;;腎小球的通透性[J];國外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊;1983年05期

3 雷大川;;實驗性通透性肺水腫[J];中國病理生理雜志;1988年05期

4 林海，龔肖崎，鐘紀根，陳駿;一種新的測定血管壁通透性的方法[J];微循環(huán)學(xué)雜志;1995年03期

5 孫君潔;;影響間隙連接的形成及其通透性的因素[J];生理科學(xué)進展;1989年02期

6 王錚摘 ,唐振;克隆病:緊密接合部的一種通透性紊亂[J];國外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊);1990年01期

7 何慧琴,丁淑華;眼底Ⅰ號方對小鼠毛細血管通透性的影響[J];中醫(yī)藥通報;2002年02期

8 崔永耀，榮征星，，張勇，鐘運琴，周冠懷;毛細血管通透性簡易檢測方法[J];上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1994年03期

9 櫘新為,_5筱n

本文編號：2302569