【摘要】：革蘭陰性桿菌感染可導(dǎo)致敗血癥、感染性休克甚至多器官功能衰竭,LPS(lipopolysaccharide,脂多糖)在發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的正常結(jié)構(gòu)成分,臨床上又稱為內(nèi)毒素。在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下,大量?jī)?nèi)毒素釋放入血,從而啟動(dòng)炎癥和損傷。研究LPS致病機(jī)制及抑制LPS對(duì)機(jī)體的損傷在臨床上具有重要意義。 LPS介導(dǎo)炎性介質(zhì)IL-1(interleukin-1,白介素-1)、TNF-a (tumor necrosis factor alpha,腫瘤壞死因子-α等的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)NO (nitric oxide,一氧化氮)、TNF-α、白細(xì)胞介素、自由基等毒性細(xì)胞因子的釋放,從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)過程中伴有大量自由基產(chǎn)生,包括超氧陰離子、過氧化氫物、氫自由基、NO等,能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),破壞脂肪酸鏈和細(xì)胞膜的完整性,損傷細(xì)胞。 炎癥是機(jī)體對(duì)各種有害刺激所產(chǎn)生的一種以防御為主的病理反應(yīng)。血管反應(yīng)是炎癥過程的中心環(huán)節(jié)。有著強(qiáng)大分泌功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞在革蘭陰性桿菌感染中有著重要的地位。內(nèi)毒素休克發(fā)生后,有效循環(huán)血量的減少和微血管通透性的增加是休克發(fā)生發(fā)展、最后導(dǎo)致組織損傷和器官功能損害的特征性表現(xiàn)。微血管通透性的增加主要取決于內(nèi)皮細(xì)胞單層的形態(tài)及細(xì)胞連接。炎癥過程的一個(gè)重要特征就是白細(xì)胞粘附、穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞,向炎癥部位滲出。這一過程的重要分子基礎(chǔ)是白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的相互作用。內(nèi)毒素能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激,啟動(dòng)粘附分子VCAM-1(vascular celll adhesion moleculer-1,血管細(xì)胞粘附分子-1)的表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞表面的VCAM-1再介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,最終引起血管通透性增加,白細(xì)胞向組織內(nèi)遷移,大量白細(xì)胞浸潤(rùn),造成組織廣泛性損傷,形成LPS誘導(dǎo)的多臟器功能損害。以上病理過程表明,氧化應(yīng)激反應(yīng)在內(nèi)毒素等引起的炎癥及組織損傷中起重要作用,也提示,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可能成為一個(gè)治療路徑,來控制革蘭陰性桿菌感染導(dǎo)致的機(jī)體損傷。 ECSOD (extracellular superoxide dismutase,細(xì)胞外超氧化物歧化酶)又稱SOD3,可清除02-生成H202和02,H202在過氧化氮酶或過氧化物酶和還原劑的作用下生成無毒性的H2O,從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞和機(jī)體組織的作用。ROS(reactive oxygen species,活性氧)和內(nèi)皮損傷在敗血癥導(dǎo)致多臟器功能障礙綜合征的發(fā)病機(jī)制中的重要性說明胞外ROS是主角。既然ECSOD為結(jié)合到血管內(nèi)皮和多個(gè)器官細(xì)胞外基質(zhì)的主要的SOD,我們?cè)O(shè)想肌肉來源的ECSOD能在疾病中發(fā)揮保護(hù)性作用。因此我們用TNF-a體外刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞,用LPS攻擊C57BL/6小鼠和肌肉來源ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠,觀察由此引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管粘附因子的表達(dá)、血管內(nèi)皮細(xì)胞及器官病理改變,研究分析ECSOD的作用及機(jī)制,有以下發(fā)現(xiàn)： 1. ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠血清中含有高濃度ECSOD。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ECSOD-TG(transgene,轉(zhuǎn)基因)小鼠血清中ECSOD的表達(dá)含量遠(yuǎn)高于WKwide type,野生型)C57BL/6小鼠血清。還在ECSOD基因轉(zhuǎn)染的HCECs(human cardiac endothelial cells,人心臟內(nèi)皮細(xì)胞)以及ECSOD-TG小鼠血清孵育后的未轉(zhuǎn)染ECSOD基因的HCECs表面,檢出ECSOD,為后續(xù)開展HCECs的有關(guān)研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 2. ECSOD能抑制TNF-α引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。HCECs在接受TNF-α刺激后迅速出現(xiàn)ROS (reactive oxygen species,活性氧)顯著升高,而這種瞬時(shí)升高現(xiàn)象并未出現(xiàn)在ECSOD血清提前共孵育的實(shí)驗(yàn)組；在觀察TNF-α刺激延遲反應(yīng)時(shí),HCECs加入TNF-α刺激4小時(shí)后,ECSOD降低了內(nèi)皮細(xì)胞在TNF-α刺激后的ROS生成。 3. ECSOD能抑制TNF-α引起的VCAM-1表達(dá)。TNF-α刺激后HCECs的VCAM-1表達(dá)增加,但在ECSOD存在的條件下,HCECs無論TNF-α刺激與否,VCAM-1的表達(dá)均未明顯增加；人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在TNF-α刺激下的細(xì)胞間粘附反應(yīng)在ECSOD存在的條件下也受到抑制,提示ECSOD抑制TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,抑制血管粘附因子的生成及單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。 4. ECSOD對(duì)LPS攻擊具有一定保護(hù)作用。ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠接受LPS20mg/kg腹腔注射,存活率明顯高于WT小鼠。 5. ECSOD能改善LPS引起的白細(xì)胞浸潤(rùn)和肺組織損傷。 (1)WT小鼠在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時(shí)后,肺部組織出現(xiàn)明顯充血和白細(xì)胞浸潤(rùn),ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時(shí)后,肺部組織表現(xiàn)基本正常。 (2)4-HNE(4-hydroxynonenal,4-羥基壬烯酸)免疫組化染色顯示,在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時(shí)后,WT小鼠肺部組織產(chǎn)生大量4-HNE, ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠肺部組織僅有少量4-HNE存在,提示LPS引起的組織氧化應(yīng)激反應(yīng)受ECSOD抑制與肺部組織損傷改善有關(guān)。 (3) VCAM-1免疫組化染色顯示,在接受LPS20mg/kg腹腔注射6小時(shí)后,WT小鼠肺部組織動(dòng)、靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1產(chǎn)生明顯增加,ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)為相對(duì)少量的VCAM-1的產(chǎn)生,與肺部組織在氧化應(yīng)激反應(yīng)被ECSOD抑制后白細(xì)胞浸潤(rùn)減少有相關(guān)性。 總之,本文在細(xì)胞學(xué)水平研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞HCECs在TNF-α刺激后,產(chǎn)生ROS增加(包括瞬間反應(yīng)和延遲反應(yīng)),內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)增加,EC-SOD能減少這種情況下內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成和VCAM-1的表達(dá),反映出我們所用的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的肌肉來源的ECSOD對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的有抑制,及相應(yīng)的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附減少的現(xiàn)象;在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平研究發(fā)現(xiàn),C57BL/6小鼠接受LPS腹腔注射后,肺部氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加、VCAM-1表達(dá)上調(diào),肺組織充血、白細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥表現(xiàn)明顯,而ECSOD轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)LPS刺激的反應(yīng)則明顯弱于前者,表現(xiàn)出顯著增高的存活率,提示肌源性ECSOD對(duì)LPS攻擊造成的致死性損傷有一定保護(hù)作用：同時(shí)此ECSOD可能通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激而減輕肺組織損傷。據(jù)此,我們認(rèn)為ECSOD作為有效的胞外氧化抑制劑,通過抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng),穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能,下調(diào)血管內(nèi)皮粘附因子表達(dá),減少白細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,從而降低白細(xì)胞的遷移率,改善組織炎癥損傷,在革蘭陰性桿菌的感染中起到了保護(hù)作用。這對(duì)于革蘭陰性桿菌感染致敗血癥甚至多臟器功能損傷的發(fā)病機(jī)制的研究及探索臨床上細(xì)胞外抗氧化措施在抗感染治療中的作用有潛在應(yīng)用價(jià)值。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

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1 盧霽明;梁寒光;;辦公樓照明設(shè)計(jì)淺議[J];燈與照明;2010年03期

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本文編號(hào)：2290963