【摘要】：研究背景及目的：煤工塵肺（Coal worker’s pneumoconiosis，CWP）是我國(guó)我省重要的職業(yè)病之一，由于其導(dǎo)致的嚴(yán)重呼吸功能障礙可對(duì)腦功能產(chǎn)生不利影響，已日益受到社會(huì)的重視。研究探討煤工塵肺對(duì)腦功能影響的原因和機(jī)制，有重要的臨床價(jià)值，也是我們醫(yī)學(xué)界義不容辭的責(zé)任。研究顯示，隨著煤工塵肺的晉級(jí)，肺功能正常率降低，肺功能障礙的危險(xiǎn)性第次增加，常常引起與肺臟損害不成比例的更加嚴(yán)重的肺功能障礙，而持續(xù)的低氧血癥和高碳酸血癥，將引起呼吸系統(tǒng)以外多器官系統(tǒng)的損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響尤為明顯，早期即可引起學(xué)習(xí)力、記憶力、計(jì)算力等認(rèn)知功能的改變，但其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、修飾、裝配折疊以及Ca2+儲(chǔ)存的重要細(xì)胞器，近年來(lái)，其在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、影響細(xì)胞存亡的作用業(yè)已日益引起廣大學(xué)者的高度重視。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，如葡萄糖缺乏、Ca2+穩(wěn)態(tài)改變、自由基損傷等導(dǎo)致蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊和積聚從而引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致特異性的細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是繼死亡受體和線(xiàn)粒體途徑之后的第三條細(xì)胞凋亡途徑。誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulum stress，ERS）的理化因素包括缺血、低氧、氧化應(yīng)激、紫外線(xiàn)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足、病毒、毒性物質(zhì)、高同型半胱氨酸血癥等，這些因素可以分別通過(guò)不同機(jī)制引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激一方面可以通過(guò)各種途徑使細(xì)胞蛋白質(zhì)合成水平下降、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)上調(diào)，提高細(xì)胞對(duì)各種刺激的抵抗能力，幫助細(xì)胞盡快恢復(fù)穩(wěn)態(tài)；另一方面，當(dāng)刺激因素持續(xù)存在或強(qiáng)度過(guò)大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)性反應(yīng)不足以恢復(fù)細(xì)胞常態(tài)時(shí)，將啟動(dòng)程序性細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 煤工塵肺形成后導(dǎo)致的長(zhǎng)期、慢性缺氧，是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激發(fā)因素。通過(guò)激活神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，，繼而激活經(jīng)由以caspase-12為起始因子和以CHOP信息分子為中心的細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，很可能是引起腦功能障礙的重要機(jī)制。 我們導(dǎo)師牛小媛教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)，在煤工塵肺與腦功能改變領(lǐng)域做了有意義的探索，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)煤工塵肺患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)病率較高，并進(jìn)行了系列的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。本項(xiàng)研究以?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激理論為指導(dǎo)，通過(guò)成功復(fù)制煤工塵肺引發(fā)認(rèn)知功能障礙的大鼠模型，探討煤工塵肺對(duì)認(rèn)知功能影響的發(fā)病機(jī)制，為臨床診斷和治療提供新思路和新策略。本項(xiàng)研究共分兩部分：第一部分，主要建立大鼠煤工塵肺以及對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的動(dòng)物模型；第二部分，，重點(diǎn)探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在煤工塵肺大鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)病中的作用。 第一部分煤工塵肺對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能影響的動(dòng)物模型的建立 研究方法：雄性Wistar大鼠100只,體重180～200g。取晉城市礦務(wù)局一級(jí)無(wú)煙煤研磨粉碎，200目鋼網(wǎng)過(guò)濾、水選，用生理鹽水配成50g/L的懸液，高壓滅菌后備用。選擇18號(hào)靜脈套管針制備氣管導(dǎo)管。捕捉大鼠，腹部消毒，用10％水合氯醛（300 mg/kg.w）經(jīng)腹腔麻醉后仰臥固定，直接經(jīng)口氣管插管，確定導(dǎo)管在氣管內(nèi)后，模型組動(dòng)物灌入煤塵生理鹽水懸液（1ml/只大鼠），正常對(duì)照組動(dòng)物灌入等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)初始時(shí)灌注1次。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在同等條件下飼養(yǎng)并自由飲食。分別在實(shí)驗(yàn)8周末和20周末，隨機(jī)各抽取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠20只，應(yīng)用Morris水迷宮系統(tǒng)分別測(cè)定其學(xué)習(xí)和記憶能力。隨后無(wú)菌操作，抽取腹主動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治觯》谓M織和腦組織，用于形態(tài)學(xué)觀察。 研究結(jié)果： 1、Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力明顯受損，并與染塵時(shí)間相關(guān)。 2、經(jīng)氣道灌注煤塵動(dòng)物隨著染塵時(shí)間延長(zhǎng)，動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）逐漸降低，PaCO2逐漸升高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物染塵后肺功能逐漸降低，并且與染塵時(shí)間有關(guān)。 3、肺組織膠原纖維（Van Gieson，VG）染色結(jié)果表明，肺組織纖維化指數(shù)隨病程進(jìn)展顯示出明顯增高性變化，說(shuō)明染塵是引起肺組織發(fā)生纖維化的重要因素。 4、肺組織病理形態(tài)學(xué)變化：光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，染塵8周可見(jiàn)肺組織中有大量煤塵沉積，間質(zhì)和肺泡區(qū)炎性反應(yīng)，肺間質(zhì)出血，部分肺泡腔中有均勻的蛋白水腫液，肺組織有破壞，間質(zhì)纖維組織增生，部分區(qū)域可見(jiàn)代償性肺氣腫； 染塵20周大鼠仍有大量煤塵沉積，可見(jiàn)吞噬了煤塵的巨大體積的巨噬細(xì)胞，水腫，病變區(qū)域肺泡壁增厚，間質(zhì)纖維組織增生明顯；代償性肺氣腫區(qū)域肺泡壁破壞，或者明顯被擠壓；可見(jiàn)多個(gè)煤塵結(jié)節(jié)。 5、腦組織病理形態(tài)學(xué)變化：光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，8周時(shí)間點(diǎn)炎性反應(yīng)明顯，總體表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、充血，膠質(zhì)細(xì)胞增多，間質(zhì)疏松、神經(jīng)細(xì)胞突起和核仁消失，提示腦組織有水腫和神經(jīng)細(xì)胞變性；部分神經(jīng)元核染色質(zhì)濃縮，可見(jiàn)少量凋亡小體。 20周時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞變性加重，核膜增厚，染色質(zhì)凝集成塊狀，核固縮更加明顯，凋亡小體較8周時(shí)間點(diǎn)增多；間質(zhì)有篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，提示有局灶性液化性壞死，可見(jiàn)核碎裂和壞死細(xì)胞。 6、腦組織神經(jīng)特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）染色計(jì)數(shù)表明，NSE高特異性的定位于神經(jīng)元，煤工塵肺組的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，提示了其導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制。 第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在煤工塵肺大鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)病中的作用 研究方法：雄性Wistar大鼠,體重180～200g,山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，模型組經(jīng)氣管灌入煤塵生理鹽水懸液（50g/L）lml/只，對(duì)照組灌入生理鹽水1ml/只。實(shí)驗(yàn)初始時(shí)灌注1次。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在同等條件下飼養(yǎng)并自由飲食。染塵后8周末，動(dòng)物經(jīng)10％水合氯醛（300 mg/kg·w）腹腔注射麻醉，將腦組織取出，部分組織液氮凍存，制作勻漿，采用生物化學(xué)法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量；部分組織于10％的中性甲醛固定，用于組織學(xué)研究。采用免疫組織化學(xué)染色方法，觀察HIF-1α、GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2的蛋白表達(dá)，在光學(xué)顯微鏡下，使用BI2000顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性染色面積進(jìn)行半定量分析；采用TUNEL法，進(jìn)行凋亡細(xì)胞染色，同樣使用BI2000顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞。 研究結(jié)果：與正常對(duì)照組相比較，模型組MDA含量、HIF-1α、GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2的蛋白表達(dá)量均明顯增加，凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率顯著升高。形態(tài)學(xué)也觀察到明顯增加的凋亡征象，充分說(shuō)明煤工塵肺8周大鼠發(fā)生的低氧血癥，引發(fā)了腦組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并引起了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 綜合上述研究結(jié)果，本項(xiàng)研究的意義在于：（1）成功復(fù)制了煤工塵肺導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的大鼠模型，為研究CWP大鼠神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；（2）深入探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制在認(rèn)知功能障礙發(fā)病中的作用。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R135.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2286457