【摘要】：目的：本研究使用博來霉素建立C57BL/6小鼠的肺纖維化模型,原代培養(yǎng)出肺成纖維細胞,MTT法篩選出活性最強的陳皮生物堿,觀察陳皮生物堿對C57BL/6小鼠肺纖維化的早期干預作用,并探討其對PGE2通路的影響。方法：1.將C 57BL/6小鼠每組10只,隨機分成正常組和模型組,利用博來霉素制備C57BL/6小鼠肺纖維化模型,通過原代培養(yǎng)獲得小鼠的肺成纖維細胞。2.將小鼠肺成纖維細胞進行傳代,用處在對數(shù)生長期的肺成纖維細胞進行實驗。采用四氮唑鹽比色法(MTT法)對陳皮生物堿在20μM濃度下進行初篩,其次設5個濃度復篩,分別是5OμM、25μM、2.5μM、6.2525μM、3.12525μM五個濃度梯度；用乳酸脫氫酶(LDH)實驗來檢測陳皮生物堿對小鼠肺成纖維細胞的毒性；篩選出活性最強的陳皮生物堿。3.C57BL/6小鼠隨機分為正常組、博來霉素組(模型組)、陳皮生物堿高劑量組(100mg/kg)、陳皮生物堿中劑量組(50mg/kg)、陳皮生物堿低劑量組(25mg/kg)、陽性對照組(強的松組)；正常組除外,其余各組均采用BLM (5mg/kg)氣管內(nèi)滴注制備肺纖維化模型；造模后第1天開始灌胃小鼠,每天按劑量灌胃一次,連續(xù)28天；正常組和模型組按100mg/kg生理鹽水灌胃；陳皮生物堿組按高、中、低劑量每天灌胃1次；陽性組按6mg/kg強的松灌服。給藥第28天時處死小鼠,取肺組織行HE染色及Masson染色觀察病理變化；按試劑盒說明檢測小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)的含量；用Elisa法測血清中的轉化生長因子(TGF-β1)及肺組織中前列腺素E2 (PGE2)的含量；蛋白印跡法(Western blotting)檢測肺組織中TGF-β1 COX-2 及 G-蛋白偶聯(lián)的跨膜受體2(E-series of prostaglandin receptor, EP2)的蛋白表達水平。結果：1.光學顯微鏡下原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細胞呈長條形或梭形,平行地排列生長；經(jīng)波形蛋白(Vimentin)及a-平滑肌蛋白(a-SMA)免疫細胞化學染色鑒定后,、imentin及α-SMA蛋白均表達于胞質(zhì),均呈黃棕色,證實所培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞；運用MTT法測出肺成纖維細胞的生長曲線：48h的時候進入對數(shù)生長期,72-96h為細胞的對數(shù)生長期,120h后細胞生長處于高峰期,然后進入平臺期。2.體外試驗：陳皮生物堿及其鹽對小鼠肺成纖維細胞均有抑制作用,其中對羥基苯乙胺鹽的抑制效果最強；LDH實驗顯示對羥基苯乙胺鹽對肺成纖維細胞的增殖抑制作用是其藥物活性并非其毒性。3.小鼠體重變化：(1)模型組小鼠體重增長速度顯著慢于正常組,并且體重比正常組有著明顯的減輕,(P0.01)(2)與模型組比較,高劑量組、中劑量組、低劑量組及強的松組的體重是增加的,但沒有顯著性。4.肺泡炎及肺纖維化積分：(1)模型組在肺泡炎程度及肺纖維化程度方面均高于正常組,差異具有統(tǒng)計學的意義(P0.01)。(2)與模型組比較,高劑量組和強的松組在肺泡炎和肺纖維化程度方面均較模型組輕,差異是有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01),中劑量組及低劑量組在肺泡炎方面較模型組有顯著性的減輕(P0.05)。5.HYP含量：模型組小鼠肺組織中的HYP含量較正常組顯著性升高的(P0.01)；與模型組比較,高劑量組、中劑量組及強的松組小鼠肺組織中HYP含量有著顯著性下降(P0.05或P0.01)。6.血清中TGF-β1含量：模型組小鼠血清中TGF-β1含量比正常組顯著增高(P0.01)；與模型組相比,高劑量組、中劑量組及強的松組小鼠血清中TGF-β1含量是顯著下降的(P0.05或P0.01)。7.肺組織中PGE2含量：模型組小鼠肺組織中的PGE2含量和正常組比較,顯著升高(P0.01)；與模型組比較,高劑量組小鼠肺組織中PGE2含量顯著增加(P0.05)。8.Western blotting檢測結果：與正常組比較,模型組小鼠肺組織中TGF-β1的蛋白表達顯著增高(P0.05),模型組肺組織中COX-2及EP2的表達與正常組比較,顯著增加(P0.05)；高劑量組及中劑量組肺組織中的TGF-β1的蛋白表達水平顯著低于模型組(P0.05),高劑量的對羥基苯乙胺鹽可以提高小鼠肺組織中COX-2及EP2的蛋白表達,有顯著性(P0.05)。結論：1.用胰蛋白酶消化法可以分離出肺纖維化肺成纖維細胞,能夠滿足實驗需要,但培養(yǎng)時間較長；并且培養(yǎng)出來的肺成纖維細胞具有肌成纖維細胞的特性,可用于肺纖維化機制的研究。2.陳皮生物堿在體外對小鼠肺成纖維細胞均有較好的抑制其增殖的作用,其中對羥基苯乙胺鹽的抑制作用最好,其對小鼠肺成纖維細胞的抑制作用是其生物活性,并非其毒性。3.對羥基苯乙胺鹽能夠改善肺纖維化小鼠的癥狀及增加其體重。4.對羥基苯乙胺鹽對BLM誘導的PF小鼠的肺泡炎及肺纖維化程度能起到一定的緩解作用。5.對羥基苯乙胺鹽可以降低PF小鼠肺組織中的HYP含量,同時還可以使PF小鼠血清和肺組織中TGF-β1的含量降低,具有一定的早期干預肺纖維化作用；可以增加PF小鼠肺組織中COX-2、PGE2及EP2的蛋白表達,其可能通過PGE2通路起到早期干預肺纖維化的作用。6.本實驗結果顯示對羥基苯乙胺鹽可能作為一種新的藥物早期干預IPF。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R563

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本文編號：2285613