【摘要】：目的：本研究使用博來(lái)霉素建立C57BL/6小鼠的肺纖維化模型,原代培養(yǎng)出肺成纖維細(xì)胞,MTT法篩選出活性最強(qiáng)的陳皮生物堿,觀察陳皮生物堿對(duì)C57BL/6小鼠肺纖維化的早期干預(yù)作用,并探討其對(duì)PGE2通路的影響。方法：1.將C 57BL/6小鼠每組10只,隨機(jī)分成正常組和模型組,利用博來(lái)霉素制備C57BL/6小鼠肺纖維化模型,通過(guò)原代培養(yǎng)獲得小鼠的肺成纖維細(xì)胞。2.將小鼠肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代,用處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用四氮唑鹽比色法(MTT法)對(duì)陳皮生物堿在20μM濃度下進(jìn)行初篩,其次設(shè)5個(gè)濃度復(fù)篩,分別是5OμM、25μM、2.5μM、6.2525μM、3.12525μM五個(gè)濃度梯度；用乳酸脫氫酶(LDH)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)陳皮生物堿對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞的毒性；篩選出活性最強(qiáng)的陳皮生物堿。3.C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、博來(lái)霉素組(模型組)、陳皮生物堿高劑量組(100mg/kg)、陳皮生物堿中劑量組(50mg/kg)、陳皮生物堿低劑量組(25mg/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(強(qiáng)的松組)；正常組除外,其余各組均采用BLM (5mg/kg)氣管內(nèi)滴注制備肺纖維化模型；造模后第1天開(kāi)始灌胃小鼠,每天按劑量灌胃一次,連續(xù)28天；正常組和模型組按100mg/kg生理鹽水灌胃；陳皮生物堿組按高、中、低劑量每天灌胃1次；陽(yáng)性組按6mg/kg強(qiáng)的松灌服。給藥第28天時(shí)處死小鼠,取肺組織行HE染色及Masson染色觀察病理變化；按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)的含量；用Elisa法測(cè)血清中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)及肺組織中前列腺素E2 (PGE2)的含量；蛋白印跡法(Western blotting)檢測(cè)肺組織中TGF-β1 COX-2 及 G-蛋白偶聯(lián)的跨膜受體2(E-series of prostaglandin receptor, EP2)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1.光學(xué)顯微鏡下原代培養(yǎng)的小鼠肺成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)條形或梭形,平行地排列生長(zhǎng)；經(jīng)波形蛋白(Vimentin)及a-平滑肌蛋白(a-SMA)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定后,、imentin及α-SMA蛋白均表達(dá)于胞質(zhì),均呈黃棕色,證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞；運(yùn)用MTT法測(cè)出肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線：48h的時(shí)候進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,72-96h為細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,120h后細(xì)胞生長(zhǎng)處于高峰期,然后進(jìn)入平臺(tái)期。2.體外試驗(yàn)：陳皮生物堿及其鹽對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞均有抑制作用,其中對(duì)羥基苯乙胺鹽的抑制效果最強(qiáng)；LDH實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)羥基苯乙胺鹽對(duì)肺成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用是其藥物活性并非其毒性。3.小鼠體重變化：(1)模型組小鼠體重增長(zhǎng)速度顯著慢于正常組,并且體重比正常組有著明顯的減輕,(P0.01)(2)與模型組比較,高劑量組、中劑量組、低劑量組及強(qiáng)的松組的體重是增加的,但沒(méi)有顯著性。4.肺泡炎及肺纖維化積分：(1)模型組在肺泡炎程度及肺纖維化程度方面均高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P0.01)。(2)與模型組比較,高劑量組和強(qiáng)的松組在肺泡炎和肺纖維化程度方面均較模型組輕,差異是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01),中劑量組及低劑量組在肺泡炎方面較模型組有顯著性的減輕(P0.05)。5.HYP含量：模型組小鼠肺組織中的HYP含量較正常組顯著性升高的(P0.01)；與模型組比較,高劑量組、中劑量組及強(qiáng)的松組小鼠肺組織中HYP含量有著顯著性下降(P0.05或P0.01)。6.血清中TGF-β1含量：模型組小鼠血清中TGF-β1含量比正常組顯著增高(P0.01)；與模型組相比,高劑量組、中劑量組及強(qiáng)的松組小鼠血清中TGF-β1含量是顯著下降的(P0.05或P0.01)。7.肺組織中PGE2含量：模型組小鼠肺組織中的PGE2含量和正常組比較,顯著升高(P0.01)；與模型組比較,高劑量組小鼠肺組織中PGE2含量顯著增加(P0.05)。8.Western blotting檢測(cè)結(jié)果：與正常組比較,模型組小鼠肺組織中TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著增高(P0.05),模型組肺組織中COX-2及EP2的表達(dá)與正常組比較,顯著增加(P0.05)；高劑量組及中劑量組肺組織中的TGF-β1的蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P0.05),高劑量的對(duì)羥基苯乙胺鹽可以提高小鼠肺組織中COX-2及EP2的蛋白表達(dá),有顯著性(P0.05)。結(jié)論：1.用胰蛋白酶消化法可以分離出肺纖維化肺成纖維細(xì)胞,能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要,但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)；并且培養(yǎng)出來(lái)的肺成纖維細(xì)胞具有肌成纖維細(xì)胞的特性,可用于肺纖維化機(jī)制的研究。2.陳皮生物堿在體外對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞均有較好的抑制其增殖的作用,其中對(duì)羥基苯乙胺鹽的抑制作用最好,其對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞的抑制作用是其生物活性,并非其毒性。3.對(duì)羥基苯乙胺鹽能夠改善肺纖維化小鼠的癥狀及增加其體重。4.對(duì)羥基苯乙胺鹽對(duì)BLM誘導(dǎo)的PF小鼠的肺泡炎及肺纖維化程度能起到一定的緩解作用。5.對(duì)羥基苯乙胺鹽可以降低PF小鼠肺組織中的HYP含量,同時(shí)還可以使PF小鼠血清和肺組織中TGF-β1的含量降低,具有一定的早期干預(yù)肺纖維化作用；可以增加PF小鼠肺組織中COX-2、PGE2及EP2的蛋白表達(dá),其可能通過(guò)PGE2通路起到早期干預(yù)肺纖維化的作用。6.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)羥基苯乙胺鹽可能作為一種新的藥物早期干預(yù)IPF。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R563

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本文編號(hào)：2285613