【摘要】：第一部分大鼠COPD模型建立及干預 背景和目的： 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種以氣流受限為特征的慢性氣道疾病,同時也是一種涉及多器官受損的全身疾病。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),部分運動受限的COPD患者表現(xiàn)為明顯的骨骼肌功能障礙。對中、重度COPD患者,骨骼肌的消耗成為預計患者病死率的重要指標之一。 COPD的骨骼肌功能障礙形成機制復雜,系統(tǒng)性炎癥在COPD患者中的存在已被廣泛接受,有人認為炎癥是COPD患者骨骼肌功能障礙的始動因素。其中腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)作為一種重要炎癥介質(zhì)已被證明參與了COPD的炎癥過程。 線粒體是骨骼肌運動所需能量的生成場所,也是活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要場所,同時也處于細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。因此,線粒體功能障礙在COPD的骨骼肌功能障礙中越來越受到重視。已有研究發(fā)現(xiàn),中重度COPD患者出現(xiàn)運動性骨骼肌萎縮、骨骼肌線粒體密度減少及結(jié)構(gòu)異常。 我們擬通過建立COPD大鼠模型,觀察COPD模型大鼠骨骼肌形態(tài)學變化及電鏡下骨骼肌纖維與線粒體變化,同時給予白藜蘆醇及AMP激活的蛋白激酶(Adenosine5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)激動劑干預。評估外周血及骨骼肌TNF-a水平與骨骼肌與線粒體的結(jié)構(gòu)形態(tài)改變的關(guān)系,為炎癥在COPD骨骼肌功能障礙中的損傷作用機制提供實驗依據(jù)。 方法： 1.COPD大鼠模型制備用兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)和反復煙熏的方法制作COPD大鼠模型。 2.分組與處理雄性SD大鼠隨機分為對照組、COPD模型組、AICAR (AMPK特異性激動劑)組和白藜蘆醇組,對照組和模型組分別給予生理鹽水、AICAR、白藜蘆醇。 3.肺功能采用無束縛小動物肺功能儀(Buxco, USA)測定大鼠肺功能變化。 4.肺和骨骼肌病理采用HE、Masson染色光學顯微鏡下觀察各組肺臟和骨骼肌的病理變化。及電鏡觀察骨骼肌與線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果： 1.各實驗組大鼠行為變化模型組及各治療組大鼠早期出現(xiàn)躁動不安、咳嗽、氣急、、進食進水量逐漸減少等表現(xiàn)。正常對照組則始終未見上述表現(xiàn)。各組體重改變差異無顯著性。 2.各實驗組大鼠肺功能變化與對照組比較,模型組大鼠PEF明顯降低(P0.01),VT明顯降低(P0.05),EF50明顯降低(P0.05)。AICAR和白藜蘆醇組PEF、均較模型組明顯升高(P0.05,P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組VT均較模型組明顯升高、EF50(P0.05)。AICAR和白藜蘆醇組EF50均較模型組明顯升高(P0.05)AICAR和白藜蘆醇組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.大鼠肺組織病理變化COPD模型組可見廣泛肺泡壁增厚、破壞,肺泡破裂、融合,小氣道纖毛脫落,氣腔狹窄,小血管壁增厚。AICAR組肺組織可見中量炎癥細胞浸潤,肺泡壁破壞、肺泡融合,肺泡腔增大；白藜蘆醇組肺組織可見中量炎癥細胞浸潤,肺泡壁破壞、小氣道纖毛脫落,氣腔狹窄。 4.骨骼肌細胞形態(tài)學觀察COPD模型組大鼠骨骼肌細胞輕度萎縮,膠原纖維沉積較對照組明顯增多。白藜蘆醇和AICAR組大鼠組骨骼肌細胞較COPD模型組大鼠膠原纖維沉積減少。透射電鏡下觀察顯示：模型組大鼠的小腿三頭肌線粒體減少,出現(xiàn)腫脹,水性變及空泡化,內(nèi)膜、嵴破壞溶解改變；白藜蘆醇組及AICAR組大鼠的小腿三頭肌線粒體結(jié)構(gòu)尚完整,肌絲完整,肌原纖維排列整齊,分布正常。 結(jié)論： 1.兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)和反復煙熏的方法可成功制作COPD大鼠模型。 2. COPD模型大鼠骨骼肌存在骨骼肌炎癥及線粒體損傷。 3. AICAR及白藜蘆醇可以改善COPD模型大鼠骨骼肌炎癥反應,減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷。 第二部分AMPK對COPD大鼠骨骼肌線粒體合成調(diào)控中的作用及白藜蘆醇作用機制探討 背景和目的： 近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),部分運動受限的COPD患者表現(xiàn)為明顯的骨骼肌功能障礙。COPD的骨骼肌功能障礙形成機制復雜,系統(tǒng)性炎癥在COPD患者中的存在已被廣泛接受,TNF-α作為一種重要炎癥介質(zhì)已被證明參與了COPD的炎癥過程。 AMPK作為真核生物細胞中一個重要的蛋白激酶,參與細胞的能量代謝過程,其通過調(diào)控代謝相關(guān)酶起作用。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)AMPK的下游靶蛋白參與能量代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。但是AMPK是否參與炎癥介導的COPD骨骼肌線粒體生物合成障礙目前一無所知。 本研究擬通過觀察大鼠外周血與骨骼肌TNF-α水平、骨骼肌AMPK表達、PGC-1α及線粒體生物合成相關(guān)基因表達的變化,進而探討炎癥狀態(tài)下COPD模型大鼠骨骼肌線粒體合成的的影響,同時給予AMPK激動劑及白藜蘆醇干預后觀察PGC-1α變化及對骨骼肌線粒體生物合成的影響,為治療COPD骨骼肌障礙提供新的理論基礎。 方法： 1. COPD大鼠模型制備與分組與處理同第一部分。 2.取材與處理采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清TNF-a濃度；小腿三頭肌留取組織勻漿,取上清液采用ELISA法檢測TNF-a濃度；采用熒光定量PCR分析檢測AMPK、NRF-1、PGC-1α、Tfam、COX ⅣmRNA表達；采用Western blotting檢測AMPK, TNF-α PGC-1α Tfam、COX Ⅳ蛋白表達。 結(jié)果： 1.不同組別血清TNF-α的水平與對照組比較,模型組大鼠血清TNF-a明顯升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組間無顯著統(tǒng)計學差異,組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.不同組別骨骼肌TNF-α的水平與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌TNFa明顯升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR組骨骼肌TNFa明顯低于白藜蘆醇組,組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.不同組別骨骼肌AMPK mRNA及蛋白表達的變化與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌AMPK mRNA相對含量明顯降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(組間比較差異具有統(tǒng)計學意義P0.01)。AICAR組AMPK mRNA相對含量明顯高于白藜蘆醇組,組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌AMPK蛋白相對含量明顯降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。白藜蘆醇組AMPK蛋白相對含量明顯低于AICAR組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.不同組別骨骼肌PGC-1a mRNA及蛋白表達的變化與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌PGC-1amRNA(?)目對含量明顯降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。AICAR組與白藜蘆醇組間無明顯統(tǒng)計學差異,組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌PGCla蛋白相對含量明顯降低,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。白藜蘆醇組PGC1a蛋白相對含量明顯高于AICAR組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 5.不同組別骨骼肌NRF-1mRNA及蛋白表達的變化與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌NRF1mRNA明顯降低(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P0.05)。AICAR組與白藜蘆醇組間無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌NRF1蛋白明顯降低(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P0.01)。白藜蘆醇組NRF1蛋白明顯高于AICAR組(P0.01)。 6.不同組別骨骼肌Tfam mRNA及蛋白表達的變化與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌Tfam mRNA明顯降低(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P0.05,P0.01)。AICAR組與白藜蘆醇組間無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌Tfam蛋白明顯降低(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P0.01)。白藜蘆醇組Tfam蛋白明顯高于AICAR組(P0.01)。7.不同組別骨骼肌COX Ⅳ mRNA及蛋白表達的變化與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌COXIVmRNA明顯降低(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P0.05)。AICAR組與白藜蘆醇組間無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。與對照組比較,模型組大鼠骨骼肌COX Ⅳ蛋白明顯降低(P0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P0.01)。白藜蘆醇組COX Ⅳ蛋白明顯高于AICAR組(P0.01)。 8.相關(guān)性分析骨骼肌TNF-a和AMPK呈負相關(guān)關(guān)系(R=-0.454,P0.01)。骨骼肌PGC-1a mRNA和AMPKmRNA呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.278,P0.05)。骨骼肌TNF-a和PGC-1amRNA呈負相關(guān)關(guān)系(R=-0.780,P0.01)。骨骼肌PGC-1a mRNA和NRFmRNA呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.685,P0.01)。骨骼肌PGC-1a mRNA和Tfam mRNA呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.800,P0.01)。 結(jié)論： 1. COPD大鼠骨骼肌存在TNF-α介導的炎癥。 2. COPD大鼠骨骼肌AMPK水平下降,PGC-1α表達下降影響骨骼肌線粒體生物合成。 3. AMPK激動劑AICAR及白藜蘆醇可通過活化AMPK,提高PGC-1α表達水平,改善了COPD運動性骨骼肌線粒體生物合成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R563

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本文編號：2280869