發(fā)布時(shí)間：2018-10-12 21:38

【摘要】：研究背景和目的： 淋巴細(xì)胞微粒(lymphocyte microparticles，LMPs)是當(dāng)淋巴細(xì)胞受刺激活化或凋亡時(shí)從漿膜上脫落下來成為直徑為0.05-1.0μm的小囊泡顆粒，可通過與靶細(xì)胞的相互作用啟動靶細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[1]。它具有抗凝、促炎反應(yīng)、加重內(nèi)皮損傷、影響血管收縮、誘導(dǎo)血管生長以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[2]，尤其在慢性炎癥方面作用突出，，現(xiàn)已證實(shí)它與自身免疫性疾病關(guān)系密切。 新近研究發(fā)現(xiàn)，LMPs能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡，能夠作用于內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素6(interleuki-6，IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleuki-8，IL-8)、前列腺素(Prostaglandin，PG)等的表達(dá)[3]，進(jìn)而在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面起重要作用，但具體機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者外周血T淋巴細(xì)胞總數(shù)下降，凋亡增加，在急性加重期尤為突出[4]。我們課題組初步發(fā)現(xiàn)COPD患者的肺泡灌洗液中LMPs水平是升高的，但凋亡的T淋巴細(xì)胞所釋放的LMPs是否對氣道上皮細(xì)胞有影響，是否在氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,目前在國內(nèi)外尚缺乏研究報(bào)道。針對這一現(xiàn)象我們加以假設(shè)展開研究。 我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LMPs能抑制人支氣管上皮細(xì)胞(Human bronchial epithelialcells，16HBE)生長，使其生長周期阻滯在G1期，并且能誘導(dǎo)其凋亡，但引起16HBE細(xì)胞生長周期阻滯的具體機(jī)制尚不完全清楚[5]。因此，本研究擬通過對細(xì)胞生長周期調(diào)控基因以及相關(guān)周期蛋白的變化檢測，探討LMPs引起16HBE細(xì)胞生長周期阻滯的機(jī)制。以期為研究LMPs在氣道炎癥中所發(fā)揮的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為下一步構(gòu)建疾病動物模型作鋪路，最終為呼吸�？瞥Ｒ姷南吐宰枞苑螝饽[等慢性氣道炎癥性疾病防治提供新的思路。 方法 本實(shí)驗(yàn)采用人類正常支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，對LMPs作用于16HBE細(xì)胞引起生長周期阻滯的相關(guān)調(diào)控蛋白進(jìn)行檢測，并對其具體機(jī)制進(jìn)行探討。具體如下： 1、LMPs致16HBE細(xì)胞生長周期阻滯相關(guān)周期蛋白的研究 1.1RT-PCR檢測P21、P27、P57、P16的mRNA的水平表達(dá) 將16HBE細(xì)胞培養(yǎng)在六孔板中到對數(shù)生長期時(shí)，20μg/ml的LMPs按照不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、20h、24h刺激16HBE細(xì)胞，提取總的RNA。采用引物延伸法，擴(kuò)展目的片段，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳跑電泳進(jìn)行分析。并用GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)。GIS密度分析軟件分析目的基因條帶的灰度值。 1.2Western blot檢測P21、 P27蛋白水平表達(dá) 將16HBE細(xì)胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期時(shí)，20μg/ml的LMPs按照不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE細(xì)胞。提取蛋白，跑電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體，ECL試劑反應(yīng)顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 2、LMPs致16HBE細(xì)胞生長周期阻滯機(jī)制的研究 2.1Western blot檢測p-FOXO1、FOXO1、p-AKT、AKT蛋白水平的表達(dá)情況 將16HBE細(xì)胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期時(shí)，20μg/ml的LMPs按照不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、24h刺激16HBE細(xì)胞。提取蛋白，跑電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體，ECL試劑反應(yīng)顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 2.2激光共聚焦觀察FOXO1蛋白的核定位變化 按照1.5×10~4個細(xì)胞/孔的密度種植16HBE細(xì)胞爬片，60-70%的融合率時(shí)，按照0h、24h的時(shí)間點(diǎn)加入濃度為20μg/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)胞。然后固定，通透，孵育抗體，染核，封片；激光共聚焦觀察。 2.3加入抑制劑LY294002后，Western blot檢測p-AKT、AKT、p-FOXO1、FOXO1蛋白水平的表達(dá)情況 60-70%的融合率時(shí)，向16HBE細(xì)胞中加入濃度為20μm/L的LY294002，共培養(yǎng)24h后，加入20μg/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)胞24h。提取蛋白，跑電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體；ECL試劑反應(yīng)顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 2.4加入抑制劑LY294002后，激光共聚焦觀察FOXO1蛋白的核定位變化 按照1.5×10~4個細(xì)胞/孔的密度種植爬片，60-70%的融合率時(shí)，向16HBE細(xì)胞中加入濃度為20μm/L的LY294002共培養(yǎng)24h后，加入濃度為20μg/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)胞24h。然后固定，通透，孵育抗體，染核，封片；激光共聚焦觀察。 2.5加入抑制劑LY294002后,Western blot檢測P21、P27蛋白水平的表達(dá)情況 60-70%的融合率時(shí)，向16HBE細(xì)胞中加入濃度為20μm/L的LY294002共培養(yǎng)24h后，20μg/ml的LMPs加入刺激16HBE細(xì)胞24h。提取蛋白，跑電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體；ECL試劑反應(yīng)顯影；圖像分析系統(tǒng)測定灰度值比值。 結(jié)果： 1、LMPs致16HBE細(xì)胞生長周期阻滯相關(guān)周期蛋白的研究 1.1濃度為20μl/ml的LMPs刺激16HBE細(xì)胞，24h能夠使其生長周期阻滯在G1期(P0.01)。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，P21、P27在mRNA水平隨著時(shí)間點(diǎn)的變化顯著升高(P0.01)，而P57、P16在mRNA水平無明顯變化(P0.05)。 1.2Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，P21、P27在蛋白水平隨時(shí)間點(diǎn)的變化表達(dá)亦明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。 2、LMPs致16HBE細(xì)胞生長周期阻滯機(jī)制的研究 2.1Western blot檢測FOXO1、p-FOXO1、AKT、p-AKT蛋白水平變化情況，結(jié)果顯示：FOXO1、AKT的總表達(dá)水平無明顯變化；但p-FOXO1、p-AKT表達(dá)水平隨時(shí)間點(diǎn)變化逐漸減弱(P0.01)。 2.2細(xì)胞免疫化學(xué)觀察到FOXO1在24h明顯入核的現(xiàn)象(與0h比較))。 2.3加入抑制劑LY294002后, FOXO1、AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但其磷酸化水平增強(qiáng)(P0.01)；FOXO1的核定位在24h后未觀察到明顯的進(jìn)核現(xiàn)象，P21、P27蛋白表達(dá)水平無明顯增高(P0.05)。 結(jié)論： 1. LMPs作用于16HBE細(xì)胞引起其生長周期阻滯在G1期，是通過上調(diào)P21、P27的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。 2. LMPs抑制16HBE細(xì)胞的生長可能與p-AKT以及FOXO1的核定位有關(guān)。 3. LMPs作用于16HBE細(xì)胞上調(diào)P21、P27蛋白的表達(dá)引起生長周期阻滯在G1期可能是通過AKT/FOXO1信號通路調(diào)節(jié)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王雙玲;陳元玉;何順華;劉峰;李冠武;;姜黃素抗急性白血病機(jī)制研究[J];汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2008年04期

2 伍曉菲,陳智超,劉仲萍,游泳,黎緯明,鄒萍;蛋白激酶抑制劑G銉6976增強(qiáng)慢性髓系白血病細(xì)胞對三氧化二砷化療敏感性的研究[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2005年01期

3 孫健;張揚(yáng);溫慶輝;張鄭瑤;周秋麗;;漢黃芩素對人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖和周期的影響[J];中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2010年18期

4 陳其奎,袁世珍,黃志清;三氧化二砷誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞周期阻滯與凋亡作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;1998年08期

5 丁新民;保庭毅;楊增悅;邱建新;巨生產(chǎn);;三氧化二砷對前列腺癌PC-3細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子的影響[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2006年06期

6 趙毅輝;李德俊;王順金;;姜黃素對SMMC-7721人肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2010年02期

7 袁響林,于世英,夏曙,胡健莉,胡國清,許三鵬;乏氧對人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期阻滯和p53表達(dá)的影響[J];中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志;2004年05期

8 苗新宇;洪振亞;易莉莎;周劍峰;;曲古抑菌素A誘導(dǎo)MOLT-4細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年03期

9 龐琳琳;于蕾;楊海帆;劉光達(dá);李海嬌;季宇彬;;野西瓜水溶性生物堿抑制HepG-2增殖作用[J];哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年04期

10 高劍;葉彬;武衛(wèi)華;孔t

本文編號：2267687