【摘要】：哮喘(Asthma)是一種常見的慢性呼吸道系統(tǒng)疾病，涉及環(huán)境因素與遺傳因素之間的復(fù)雜相互作用，是公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。然而其生理病理機(jī)制至今還沒有得到完全地解釋。有研究表明，哮喘的病理機(jī)制中包括氣道重塑(airway remodeling)，氣道炎癥(Airway inflammation)以及氣道高反應(yīng)性(Airway hyperresponsiveness，AHR)等。目前國際上公認(rèn)的哮喘可能的發(fā)病機(jī)制是，氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cell, ASMC)自身生物力學(xué)屬性發(fā)生改變，當(dāng)受到外界理化因素刺激時，其反應(yīng)性增強(qiáng)導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性與氣道狹窄以及隨之而來的呼吸功能障礙。因此氣道平滑肌生物力學(xué)屬性變異作為此途徑的終極因素成為研究哮喘生理病理機(jī)制的重點。 近年來，通過定位克隆和全基因組篩查技術(shù)確定了去整合素堿金屬蛋白酶33(A disintegrin and metalloproteinase33, ADAM33)是一種哮喘易感基因，且發(fā)現(xiàn)ADAM33基因與哮喘疾病特征的氣道炎癥和組織重構(gòu)具有一定聯(lián)系。然而與氣道炎癥同等重要的哮喘氣道病理變化是源于ASMC生物力學(xué)屬性改變所導(dǎo)致的AHR，且已有研究表明ADAM33在哮喘患者氣道組織的間充質(zhì)層包括成纖維層、基底膜和平滑肌層上的表達(dá)水平比正常人高。由此認(rèn)為在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)與ASMC生物力學(xué)屬性是否具有一定的相關(guān)性、以及ADAM33蛋白的表達(dá)是否參與調(diào)控ASMC力學(xué)特性。為了解決這個問題，本課題采用卵清蛋白(OVA)致敏新生雄性SD大鼠構(gòu)建哮喘動物模型，在此基礎(chǔ)上分離純化ASMC在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)，研究哮喘病理氣道中ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)水平，及其與ASMC生物力學(xué)行為之間的相關(guān)性，同時檢測在體外調(diào)控ADAM33蛋白表達(dá)后ASMC細(xì)胞生物力學(xué)行為的響應(yīng)，研究兩者之間的關(guān)系。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： ①研究了不同程度OVA致敏雄性SD大鼠哮喘模型ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)水平。首先將新生雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，哮喘組在第1和第7天時注射含1%OVA和10%Al(OH)3的混合鹽溶液，第15天起用1%OVA每周霧化3次，分別持續(xù)4、6和12周以建立不同程度慢性O(shè)VA致敏動物，正常對照組動物用相同的實驗方案采取同等劑量的生理鹽水處理。從動物模型中分離、獲取ASMC并在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代至2-5代用于各項實驗。當(dāng)細(xì)胞長至90%融合時，提取總蛋白，將等體積的蛋白溶液加入到10%SDS-PAGE膠中，隨后用免疫印記方法(western blot)檢測細(xì)胞中ADAM33蛋白表達(dá)水平，實驗結(jié)果表明OVA致敏組ASMC中ADAM33蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(p0.001)，增加水平在OVA致敏4周時達(dá)到最大，致敏6和12周表達(dá)水平漸次； ②研究了正常與OVA致敏來源的ASMC生物力學(xué)屬性。從氣道的功能來看，ASMC的力學(xué)屬性被認(rèn)為是決定哮喘病癥之一氣道高反應(yīng)的最終途徑。因此本研究綜合采取光學(xué)磁粒扭轉(zhuǎn)細(xì)胞測量儀(Optical Magnetic Twisting Cytometry,OMTC)、傅立葉變換牽引力顯微術(shù)(Fourier Transform Traction Microscopy,FTTM)、Transwell小室法以及免疫熒光染色技術(shù)檢測包括細(xì)胞剛度和收縮性、細(xì)胞牽引力、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)在內(nèi)的細(xì)胞力學(xué)屬性。實驗結(jié)果表明，與對照組相比OVA致敏組ASMC細(xì)胞剛度增加，致敏4周時具有顯著性差異(p0.05)，隨后漸次，然而各組細(xì)胞對KCl激動劑的響應(yīng)沒有顯著性差異。同樣，OVA致敏組中ASMC牽引力提高，尤其在OVA致敏4周時具有顯著性差異(p0.05)，隨后隨著致敏時間的增加有所降低。OVA致敏組ASMC的遷移能力增加，同樣的致敏4周時達(dá)到最大具有顯著性差異(p0.001)。致敏組ASMC中包括F-actin和Vinculin的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)較對照組有所提高，特別是致敏4周時，Vinculin的表達(dá)具有顯著性差異（p0.001）。 ③分析了ADAM33蛋白表達(dá)水平與ASMC力學(xué)屬性之間的相關(guān)性。實驗結(jié)果表明，ASMC的ADAM33蛋白表達(dá)的變化和ASMC力學(xué)屬性的改變對OVA致敏具有相同的響應(yīng)趨勢，暗示兩者之間似乎具有一定的相關(guān)性。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ASMC中ADAM33蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞剛度、細(xì)胞牽引力、細(xì)胞遷移以及包括F-actin和Vinculin的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)在內(nèi)的細(xì)胞力學(xué)屬性具有很強(qiáng)的正相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)Cp：分別是0.864，0.716，0.67，0.662，0.774，如表3.1所示)。 ④研究了調(diào)控ADAM33蛋白表達(dá)后ASMC細(xì)胞力學(xué)屬性的響應(yīng)。用上述實驗中發(fā)現(xiàn)的蛋白表達(dá)與力學(xué)屬性改變最大的OVA致敏4周的ASMC，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的辦法構(gòu)建沉默ADAM33蛋白表達(dá)的ASMC組，然后檢測細(xì)胞的力學(xué)屬性響應(yīng)。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無處理對照組(4weeks)以及慢病毒轉(zhuǎn)染對照組(GFP)相比，沉默組(pLVT453)細(xì)胞的剛度與細(xì)胞牽引力都顯著下降(p0.05)。 這些結(jié)果表明，ADAM33蛋白與ASMC生物力學(xué)屬性具有很強(qiáng)的正相關(guān)性，同時與ASMC力學(xué)屬性的改變有著直接的聯(lián)系，并進(jìn)而在氣道高反應(yīng)性這一哮喘病理因素中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過研究ADAM33的表達(dá)對ASMC生物力學(xué)行為的影響及其內(nèi)在調(diào)控機(jī)理，有助于進(jìn)一步揭示支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，，為探索更好的哮喘病治療靶點提供科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:Asthma is a common chronic respiratory disease, involving the complex interaction between environmental factors and genetic factors. It is a recognized medical problem, seriously threatening human life and health. However, its physiological and pathological mechanisms have not been fully explained. Studies have shown that the pathogenesis of asthma includes airway. Airway remodeling, airway inflammation, and airway hyperresponsiveness (AHR) have been widely recognized as possible pathogenesis of asthma. The enhancement of airway responsiveness leads to airway hyperresponsiveness, airway stenosis and subsequent respiratory dysfunction. Therefore, the variation of airway smooth muscle biomechanical properties as the ultimate factor in this pathway has become the focus of the study on the physiological and pathological mechanism of asthma.
In recent years, disintegrin and metalloproteinase 33 (ADAM33) has been identified as a susceptible gene for asthma by localized cloning and genome-wide screening techniques, and it has been found that ADAM33 gene is associated with airway inflammation and tissue remodeling characterized by asthma. The pathological changes of airway in asthma are caused by the changes of biomechanical properties of ASMC, and the expression of ADAM33 in the airway mesenchymal layer including fibroblast layer, basement membrane and smooth muscle layer of asthmatic patients is higher than that of normal people. To solve this problem, we used ovalbumin (OVA) sensitized neonatal male SD rats to construct an asthmatic animal model, and then isolated and purified ASMC for primary culture in vitro to study asthmatic pathological qi. The expression level of ADAM33 protein in ASMC and its correlation with the biomechanical behavior of ASMC were studied. The response of ASMC cells to the biomechanical behavior of ADAM33 protein was also detected in vitro.
(1) The expression of ADAM33 protein in ASMC of male SD rats sensitized by OVA was studied. Firstly, neonatal male SD rats were randomly divided into 4 groups. Asthma group was injected with mixed saline solution containing 1% OVA and 10% Al (OH) 3 on the 1st and 7th day, and 1% OVA was atomized three times a week on the 15th day for 4, 6 and 12 weeks respectively to establish different degrees of chronic OVA. VA-sensitized animals and normal control animals were treated with the same dosage of normal saline. ASMCs were isolated from animal models and cultured in vitro. Cells were subcultured to 2-5 generations for various experiments. When the cells grew to 90% fusion, total proteins were extracted and the same volume of protein solution was added to 10% SDS-PAGE. The expression of ADAM33 protein in ASMC of OVA sensitized group was significantly higher than that of control group (p0.001). The expression level of ADAM33 protein in ASMC of OVA sensitized group reached the maximum at 4 weeks, and gradually increased at 6 and 12 weeks.
(2) The biomechanical properties of ASMC from normal and OVA sensitized sources were studied. The mechanical properties of ASMC were considered to be the ultimate way to determine airway hyperresponsiveness in asthmatic patients. Fourier Transform Traction Microscopy (FTTM), Transwell chamber assay and immunofluorescence staining were used to detect the cellular mechanical properties including cell stiffness and contractility, cell traction, cell migration and cytoskeletal structural protein expression. Similarly, the traction of ASMC in OVA sensitized group increased significantly, especially in OVA sensitized 4 weeks (p0.05), and then decreased with the increase of sensitization time. The migration ability of ASMC in OVA sensitized group decreased. The expression of cytoskeleton structural protein including F-actin and Vinculin in ASMC of the sensitized group was higher than that of the control group. Especially, the expression of Vinculin in ASMC of the sensitized group was significantly higher than that of the control group at 4 weeks (p0.001).
(3) The correlation between ADAM33 protein expression and mechanical properties of ASMC was analyzed. The results showed that the changes of ADAM33 protein expression and mechanical properties of ASMC had the same response trend to OVA sensitization, suggesting that there was a certain correlation between them. Pearson correlation coefficients Cp: 0.864, 0.716, 0.67, 0.662, 0.774 respectively, as shown in Table 3.1.
(4) The response of mechanical properties of ASMC cells to ADAM33 protein expression was studied. ASMC cells were sensitized by OVA with the greatest change of protein expression and mechanical properties found in the above experiments for 4 weeks. The ASMC group silenced ADAM33 protein expression was constructed by lentivirus transfection, and then the mechanical properties of ASMC cells were detected. Compared with the untreated control group (4weeks) and lentivirus transfection control group (GFP), the stiffness and traction of cells in the silent group (pLVT453) were significantly decreased (p0.05).
These results indicate that ADAM33 protein has a strong positive correlation with the biomechanical properties of ASMC, and is directly related to the changes of mechanical properties of ASMC, and plays a key role in airway hyperresponsiveness, a pathological factor of asthma. It is helpful to further reveal the pathogenesis of bronchial asthma and provide scientific basis for exploring better therapeutic targets of asthma.
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R562.25

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 葉濤;徐永健;張珍祥;劉先勝;楊朝;曹勇;李亞清;;一氧化氮對被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞鉀通道的作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2006年04期

2 徐紀(jì)民;王雅姝;宋愛晶;龍皎月;蔡開勇;鄧林紅;;曲率梯度微圖形培養(yǎng)的氣道平滑肌細(xì)胞流變學(xué)研究[J];醫(yī)用生物力學(xué);2009年S1期

3 林雅芳;沈健藩;;麻醉與氣道平滑肌受體[J];國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志;1992年04期

4 徐軍,任筱蘭,鐘南山;粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子對人氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮素-1及內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶基因表達(dá)的影響及茶堿對其的作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;1997年05期

5 陳愛歡!510120,鐘南山!510120;半胱氨酰白三烯受體拮抗劑對氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)皮素1表達(dá)的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2000年10期

6 劉先勝;徐永健;張珍祥;熊盛道;劉謹(jǐn);;川芎嗪對正常及致敏豚鼠以及人離體氣道平滑肌蛋白激酶C信號通道功能的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2000年S1期

7 徐峰;白介素-1參與支氣管哮喘的相關(guān)機(jī)制[J];國外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊;2002年06期

8 駱仙芳;蔡宛如;王會仍;;氣道平滑肌的增殖和分泌[J];國際呼吸雜志;2006年05期

9 趙燕霞;羅雅玲;賴文巖;徐健;任敦強(qiáng);黎振興;;紫草素抑制人氣道平滑肌細(xì)胞的增殖[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年05期

10 韓志遠(yuǎn);許繼德;白洪波;;姜黃素抑制大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2008年20期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張筱娟;徐紀(jì)民;陳沖;王雅姝;蔡開勇;鄧林紅;;氣道平滑肌細(xì)胞的三維培養(yǎng)和生物力學(xué)研究[A];2008年全國生物流變學(xué)與生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2008年

2 張筱娟;蔡開勇;鄧林紅;;氣道平滑肌細(xì)胞的三維培養(yǎng)和生物力學(xué)研究[A];第九屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

3 周錦桃;孫異鋒;劉朝暉;;ADAM33基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

4 徐紀(jì)民;陳沖;王雅姝;蔡開勇;鄧林紅;;軟刻技術(shù)構(gòu)建的微圖形上培養(yǎng)的氣道平滑肌細(xì)胞微流變學(xué)研究[A];2008年全國生物流變學(xué)與生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2008年

5 胥武劍;寧允葉;洪偉峻;邵艷;蔡在龍;李強(qiáng);;組蛋白去乙�；富钚詫ο瓪獾榔交〖�(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第七屆全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第三次大會論文匯編[C];2010年

6 寧允葉;李強(qiáng);;5-aza-dC抑制PDGF誘導(dǎo)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

7 萬璇;趙建平;;支氣管哮喘氣道平滑肌細(xì)胞線粒體膜ATP敏感鉀通道對PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細(xì)胞增殖的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第七屆全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第三次大會論文匯編[C];2010年

8 葉濤;徐永健;韋國楨;楊朝;張珍祥;;一氧化氮對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及c-fos與c-jun表達(dá)的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國呼吸病學(xué)術(shù)會議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

9 戴元榮;吳斌;;P27Kip-1蛋白對線粒體介導(dǎo)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞凋亡的影響[A];浙江省醫(yī)學(xué)會呼吸系病分會成立三十周年慶典活動暨2008年呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

10 戴元榮;吳斌;;P27Kip-1蛋白對線粒體介導(dǎo)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞凋亡的影響[A];2008年浙江省內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 李美同;對鹽酸克侖特羅中毒事件的再認(rèn)識[N];中國畜牧報;2002年

2 田學(xué)科;了解健康狀況用“電子貼”[N];科技日報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 徐紀(jì)民;微圖形梯度曲率對氣道平滑肌細(xì)胞生理學(xué)和生物力學(xué)行為影響的研究[D];重慶大學(xué);2011年

2 張旃;IL-22對氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞作用的初步探討[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

3 劉阿茹;轉(zhuǎn)化生長因子β1對哮喘氣道重建的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 鄭宏宇;白介素-4在支氣管哮喘發(fā)病學(xué)中的作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

5 胡海洋;平滑肌祖細(xì)胞參與哮喘氣道重塑的探索性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

6 遲翔宇;ADAM33基因在支氣管哮喘發(fā)病中的研究[D];山東大學(xué);2011年

7 龍皎月;哮喘易感基因ADAM33對氣道平滑肌細(xì)胞力學(xué)行為的影響[D];重慶大學(xué);2012年

8 王英;Ryanodine及inositol-1，4， 5-triphosphate受體在氣道平滑肌中的表達(dá)及其在哮喘氣道重塑中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

9 宋穎芳;1，25-二羥維生素D_3在哮喘氣道重塑中的作用及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 張曉宇;香煙提取物通過周期蛋白D1促進(jìn)支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖[D];華中科技大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 林峰;ADAM33表達(dá)量與氣道平滑肌細(xì)胞生物力學(xué)屬性的關(guān)系研究[D];重慶大學(xué);2013年

2 趙國棟;兩種共培養(yǎng)模型中上皮細(xì)胞在壓力下對氣道平滑肌細(xì)胞的影響[D];重慶大學(xué);2010年

3 李寧;血管緊張素Ⅱ和血管緊張素-（1-7）對人氣道平滑肌細(xì)胞收縮的調(diào)控機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

4 樊磊磊;壓力對共培養(yǎng)上皮細(xì)胞下的氣道平滑肌細(xì)胞影響的研究[D];重慶大學(xué);2010年

5 王晟;溫敏性細(xì)胞培養(yǎng)基底的制備及其對平滑肌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的生長與粘附行為的影響[D];重慶大學(xué);2010年

6 苗麗;Sunitinib對氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

7 韋江紅;Toll樣受體4對哮喘氣道平滑肌細(xì)胞的合成分泌及增殖凋亡的作用研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2010年

8 張學(xué)平;黃芪多糖抑制氣道平滑肌細(xì)胞α-SMA的表達(dá)[D];山東大學(xué);2011年

9 趙建紅;哮喘致敏血清和細(xì)胞因子引起的氣道平滑肌細(xì)胞FKBP12.6表達(dá)下調(diào)及其與應(yīng)激時鈣釋放的關(guān)系[D];華中科技大學(xué);2010年

10 任欣欣;LN-整合素α_7信號通路對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞分泌功能的影響[D];華中科技大學(xué);2012年

本文編號：2243638