【摘要】：研究背景及目的 花生四烯酸(arachidonic acid，AA)是人體內(nèi)含量最豐富，性質(zhì)最活躍的多不飽和脂肪酸之一，在體內(nèi)主要通過三種不同的途徑進行酶解代謝，⑴AA經(jīng)環(huán)氧化酶(cyclooxygenases，COX)途徑代謝；⑵AA經(jīng)脂質(zhì)氧化酶(lipoxygenase，LOX)途徑代謝；⑶AA經(jīng)細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)氧化酶途徑代謝CYP450氧化酶包括CYP450表氧化酶(cytochrome P450epoxygenase)亦有稱之為環(huán)加氧酶途徑和ω-羥化酶途徑，CYP450表氧化酶是一個巨大的氧化酶超家族，CYP450表氧化酶主要包括2C和2J兩類，目前已發(fā)現(xiàn)CYP450表氧化酶6個克隆的2J類型，其中在人類中僅發(fā)現(xiàn)了CYP2J2，通過細胞色素P450表氧化酶途徑，花生四烯酸代謝生成環(huán)氧-二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs），EETs在生物體內(nèi)，尤其是在人體內(nèi)的病理生理學(xué)及生物學(xué)意義，尚未被完全認知和闡明 既往大量研究證據(jù)表明：CYP表氧化酶-EETs系統(tǒng)主要在體內(nèi)各個系統(tǒng)發(fā)揮以下幾方面的作用：⑴EETs具有強大的擴張血管和調(diào)節(jié)血壓功能；⑵EETs可顯著下調(diào)由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞和心肌細胞的凋亡；⑶EETs可以顯著抑制炎癥反應(yīng)中由TNF-α所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥黏附分子的表達，減輕損傷；⑷EETs可以促進內(nèi)皮細胞增殖，抑制內(nèi)皮細胞凋亡，促進組織新生血管形成，⑸EETs可以使纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）活化，這在維持體內(nèi)血栓形成/溶栓的平衡過程中可能發(fā)揮重要作用；⑹EETs可以抑制主動脈平滑肌細胞由轉(zhuǎn)移生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)所誘導(dǎo)的遷移；⑺缺氧-復(fù)氧過程可明顯下調(diào)CYP2J2基因在血管內(nèi)皮細胞中的表達，通過增加外源性EETs或CYP2J2過表達途經(jīng)可以改善細胞缺氧-復(fù)氧損傷 肺缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury，，LIRI)一直是胸外科面臨的重要問題，它在多種臨床情況下發(fā)生，如肺移植ǎ心肺聯(lián)合移植ǎ袖狀肺葉切除ǎ肺動脈成形術(shù)ǎ體外循環(huán)ǎ肺栓塞ǎ休克以及心肺復(fù)蘇等，肺缺血再灌注損傷可導(dǎo)致組織炎性細胞浸潤增加，產(chǎn)生并釋放大量氧自由基，損害細胞，它對于保護肺功能ǎ降低術(shù)后死亡率，延長移植器官的存活時間，減輕全身炎癥反應(yīng)綜合癥及多器官功能障礙綜合征的發(fā)生，尤其是減少急性肺損傷導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合征具有重要意義近年來，我國肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年攀升，目前已排在各種惡性腫瘤發(fā)病的第一位，越來越多的肺癌患者需要外科手術(shù)治療，切除病變肺組織加系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃依舊是目前能夠最為徹底治療肺癌的手段肺外科手術(shù)逐年增多，如何最大限度地為患者保存健肺以改善其長期的生活質(zhì)量，如何為一部分肺功能較差的患者爭取手術(shù)機會，如何盡可能的減輕外科手術(shù)操作過程中缺血再灌注損傷對殘留健康肺組織的損害，最大可能保護肺功能，減少并發(fā)癥的發(fā)生，改善患者生活質(zhì)量等問題，就顯得更加有意義了 缺血再灌注損傷的發(fā)生機制十分復(fù)雜，既往的大量研究表明：缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展與白細胞的活化ǎ多種促炎癥反應(yīng)介質(zhì)釋放ǎ多種炎癥相關(guān)蛋白酶的釋放，氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生ǎ氧自由基增多ǎ細胞內(nèi)鈣超載ǎ多種轉(zhuǎn)錄因子的激活ǎ細胞膜分子上調(diào)，生物膜損傷以及保護性物質(zhì)如NO和肺表面活性物質(zhì)減少等諸多因素相關(guān)，隨著對肺缺血再灌注損傷本質(zhì)認識的不斷深入，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激機制參與了肺缺血再灌注損傷與血管內(nèi)皮功能的紊亂的發(fā)生ǎ發(fā)展，并影響結(jié)局，從本質(zhì)上講，缺血再灌注損傷是一種炎癥反應(yīng)，炎癥趨化因子表達的增加導(dǎo)致肺組織局部炎癥細胞大量浸潤，浸潤的炎癥細胞又導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，氧化應(yīng)激又可以促進炎癥細胞的募集，又進一步炎癥粘附因子的表達增加，加重細胞損傷，促進細胞凋亡 基于以上結(jié)果，在本研究中我們設(shè)想，能否通過激活內(nèi)源性保護機制，改善肺缺血再灌注損傷？我們首先在動物體內(nèi)過表達CYP2J2基因，再構(gòu)建CYP2J2基因過表達動物肺缺血再灌注損傷的模型，觀察CYP2J2基因?qū)Ψ稳毖俟嘧p傷的影響，達到預(yù)防和改善肺缺血再灌注損傷的目的本研究中，將攜帶CYP2J2目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入Wistar大鼠體內(nèi)，確認CYP2J2基因在大鼠體內(nèi)獲得穩(wěn)定表達并代謝AA生成EET后，構(gòu)建大鼠單側(cè)肺缺血再灌注損傷模型，研究細胞色素P450表氧化酶-EETs系統(tǒng)對大鼠肺缺血再灌注損傷的影響及其可能的作用機制，旨在從整體動物水平闡明細胞色素P450表氧化酶在肺缺血再灌注損傷中的保護作用及其作用機制，試圖探索研究CYP2J2能否抑制或阻斷肺缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，以期達到預(yù)防和治療肺缺血再灌注損傷的目的，以期通過本研究為臨床防治肺缺血再灌注損傷及更深入的研究提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論支持 實驗方法和結(jié)果 實驗方法 1.采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒自大腸桿菌DH5α菌液中大量提取攜帶目的基因2J2的pcDNA3.1(+)-2J2表達載體質(zhì)粒及攜帶對照基因GFP的pcDNA3.1(+)-GFP表達載體的質(zhì)粒 2.健康雄性Wistar大鼠50只，12周齡，體重320g～380g，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中SPF級標準動物飼養(yǎng)室，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周隨機分為5組：Blank組：空白對照組（Blank，10只）ǎSham組：單純開胸組（Sham，10只）ǎIR組：左肺缺血再灌注組（IR，10只）ǎIR+GFP組：GFP基因?qū)?左肺缺血再灌注組（IR+GFP，10只）ǎIR+2J2組：2J2基因?qū)?左肺缺血再灌注（IR+2J2，10只）在行左肺缺血再灌注損傷造模手術(shù)操作前2周，按照3mg/kg體重/次，1次/周，共注射2次，經(jīng)大鼠尾靜脈注射攜帶目的基因的質(zhì)粒溶液，IR+GFP組給予注射pcDNA3.1(+)-GFP質(zhì)粒溶液，IR+2J2組給予注射pcDNA3.1(+)-2J2質(zhì)粒溶液，Blank組ǎSham組和IR組在相同時間點經(jīng)尾靜脈注射同等體積生理鹽水，第2次注射完成后1周進行造模手術(shù)操作，按分組要求進行手術(shù)，操作完畢后，處死動物，留取肺組織ǎ血液ǎ肺泡灌洗液等樣本所有的針對動物的實驗操作程序均符合中華人民共和國國家科學(xué)技術(shù)委員會ǎ實驗動物管理條例ǐ及ǎ湖北省實驗動物管理條例ǐ所制定的標準及規(guī)范 3.具體造模實驗方法如下：①Blank組：不執(zhí)行任何手術(shù)操作，麻醉后處死動物，留取標本；②Sham組：麻醉，氣管插管，單純左側(cè)開胸，僅顯露左肺門，注射肝素，暫時合攏手術(shù)切口，不執(zhí)行肺缺血再灌注操作，觀察180min后處死動物，留取標本；③IR組：麻醉，氣管插管，左側(cè)開胸，暴露左側(cè)肺門，注射肝素，在肺充氣狀態(tài)下，顯微無創(chuàng)血管夾阻斷左側(cè)肺門，暫時合攏手術(shù)切口，阻斷60min后(模擬缺血)，松開血管夾，關(guān)閉胸腔，繼續(xù)呼吸機輔助呼吸，觀察120min后（模擬再灌注），處死動物，留取標本；④IR+GFP組：給予注射攜帶GFP基因的質(zhì)粒，造模手術(shù)操作過程同IR組；⑤IR+2J2組：給予注射攜帶2J2目的基因的質(zhì)粒，造模手術(shù)操作過程同IR組 4. Western blot檢測各組大鼠肺組織中CYP2J2蛋白表達水平，ELISA方法檢測大鼠肺組織中14,15-EET含量 5.處死動物前每組隨機將半數(shù)動物用Millar導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)頸靜脈插管至右心室，記錄右心室血流動力學(xué)指標，檢測CYP2J2過表達對大鼠右心舒縮功能的影響 6.檢測大鼠左肺組織濕干重比，檢測血清與左肺BALF蛋白濃度之比，檢測CYP2J2過表達對肺毛細血管通透性的影響 7.觀察大鼠肺組織缺血再灌注損傷后大體及切片HE染色光鏡下病理改變 8.觀察大鼠肺組織缺血再灌注損傷后切片TUNEL染色光鏡下細胞凋亡情況 9.檢測大鼠血清及肺組織中炎癥因子及炎癥相關(guān)粘附因子的水平及CYP2J2過表達對炎癥的影響：ELISA方法檢測血清TNF-α，IL-1β，IL-8，IL-10，sP-selectin，sE-selectin的水平Western blot及實時熒光定量PCR檢測肺組織中ICAM-1，VCAM-1的表達 10.檢測大鼠血清及肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標及CYP2J2過表達對氧化應(yīng)激的影響：實時熒光定量PCR方法檢測大鼠肺組織中eNOS，XOD，NADPH P22phox，NADPH P67phoxmRNA表達；ELISA方法檢測血清COX的水平 11. Western blot檢測大鼠肺組織標本中PI3K，Akt，p-Akt及NF κB-p65蛋白質(zhì)的表達水平及CYP2J2過表達對其表達的影響 實驗結(jié)果 1.通過經(jīng)尾靜脈注射質(zhì)粒導(dǎo)入的方法，成功將CYP2J2基因?qū)氪笫篌w內(nèi)，經(jīng)WesternBlot及ELISA方法驗證：CYP2J2基因在大鼠肺組織中獲得穩(wěn)定表達，并代謝AA產(chǎn)生EET，顯著提高了肺組織中EETs水平 2. CYP2J2過表達對大鼠缺血再灌注后左肺組織炎癥反應(yīng)及細胞凋亡影響 大鼠左肺組織大體及石蠟切片HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示：缺血再灌注后大鼠肺泡腔內(nèi)可見較多漿液性炎性滲出物，大量炎性細胞浸潤，肺泡纖維間隔明顯水腫ǎ增厚，部分區(qū)域間隔組織破壞；小葉間動脈充血ǎ擴張；部分肺泡腔內(nèi)可見肺泡巨噬細胞浸潤，支氣管壁周圍可見炎癥細胞浸潤；部分區(qū)域可見點狀ǎ片狀肺組織壞死，顯示大鼠左肺缺血再灌注損傷模型制作成功；CYP2J2過表達可顯著抑制大鼠左肺缺血再灌注損傷后炎性滲出，可明顯減輕缺血再灌注損傷后肺組織內(nèi)中性粒細胞ǎ巨噬細胞等炎癥反應(yīng)細胞的浸潤，提示CYP2J2過表達可明顯減輕肺缺血再灌注損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng) 各組大鼠肺組織切片TUNEL染色及凋亡指數(shù)計算結(jié)果顯示：與Blank組（AI=0.188%±0.0896%）及Sham組（AI=0.182%±0.0464%）比較，IR組（AI=3.732%±0.4896%），IR+GFP組（AI=3.622%±0.3656%），IR+2J2組（AI=2.236%±0.4968%），均顯著升高，缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)大鼠肺組織細胞發(fā)生明顯凋亡（P＜0.01）；與IR組和IR+GFP組比較，IR+2J2組AI明顯減�。≒＞0.05），CYP2J2過表達顯著減少了缺血再灌注損傷誘發(fā)的細胞凋亡 3. CYP2J2過表達對大鼠左肺缺血再灌注損傷后肺毛細血管通透性的影響 IR+2J2組大鼠左肺濕干重比值（W/D（）5.215±0.860）明顯低于IR組的（7.061±1.189）和IR+GFP組的（8.048±0.489）（P＜0.05），但均顯著高于Blank組（4.075±0.729）及Sham組（4.700±0.645）的W/D（P＜0.05），Blank組和Sham組之間，IR組和IR+GFP組之間W/D差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05） IR+2J2組大鼠血清與左肺BALF蛋白濃度比值（30.306±2.4956）明顯高于IR組（17.727±1.870）和IR+GFP組（18.414±1.993）（P＜0.05），但均小于Blank組（44.463±4.023）及Sham組（43.005±1.703），Blank組和Sham組之間，IR組和IR+GFP組之間血清與左肺BALF蛋白濃度比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05） 缺血再灌注損傷可導(dǎo)致肺毛細血管通透性明顯增大，表現(xiàn)為肺濕干重比值增加及血清與BALF中蛋白濃度比值降低，CYP2J2過表達可明顯降低肺毛細血管通透性，減輕缺血再灌注肺組織內(nèi)蛋白液體的滲出 4.血清ǎ肺組織中炎癥相關(guān)因子檢測結(jié)果 ELISA方法檢測大鼠血清中相關(guān)炎癥因子水平的結(jié)果表明：CYP2J2基因過表達顯著降低了缺血再灌注損傷后大鼠血清中炎癥因子的水平IR+2J2組血清TNF-α水平（124.182±12.734pg/ml）顯著低于IR組（191.554±19.603pg/ml）和IR+GFP組（183.246±14.443pg/ml），但均高于Blank組（41.224±12.443pg/ml）和Sham組（93.004±12.701pg/ml）；IR+2J2組血清IL-1β水平（74.393±9.029pg/ml）顯著低于IR組（110.516±24.519pg/ml）和IR+GFP組（103.704±15.872pg/ml），但均高于Blank組（50.039±12.318pg/ml）和Sham組（62.018±12.319pg/ml）；IR+2J2組血清IL-8水平（55.330±6.608pg/ml）顯著低于IR組（67.754±8.797pg/ml）和IR+GFP組（65.008±7.670pg/ml），但均高于Blank組（36.757±6.051pg/ml）；IR+2J2組血清IL-10水平（191.473±4.639pg/ml）顯著高于IR組（125.792±6.256pg/ml）和IR+GFP組（123.279±7.453pg/ml），以上三組均高于Blank組（46.828±5.010pg/ml）和Sham組（53.987±4.925pg/ml）；IR+2J2組血清sP-Selectin水平（38.297±3.3527ng/ml）顯著低于IR組（56.732±5.985ng/ml）和IR+GFP組（55.616±5.455ng/ml），但均高于Blank組（6.259±1.631ng/ml）和Sham組（19.951±4.166ng/ml） IR+2J2組血清sE-Selectin水平（1312.109±211.164pg/ml）顯著低于IR組（1779.279±322.441pg/ml）和IR+GFP組（1775.263±261.194pg/ml），但均高于Blank組（500.193±162.362pg/ml）和Sham組（930.488±192.240pg/ml） RT-PCR檢測及western blot檢測結(jié)果同樣表明：缺血再灌注導(dǎo)致肺組織內(nèi)ICAM-1ǎVACM-1表達水平顯著上調(diào)；CYP2J2基因過表達顯著抑制了缺血再灌注后ICAM-1ǎVACM-1表達水平的上調(diào)，從而抑制了單核巨噬細胞向內(nèi)皮細胞的粘附以及以及向血管組織的遷移，減輕炎癥損傷 5.血清ǎ肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標檢測結(jié)果 缺血再灌注損傷可導(dǎo)致血清中COX水平顯著升高，CYP2J2基因過表達未能明顯降低LIRI大鼠血清中COX水平；肺缺血再灌注損傷可導(dǎo)致大鼠肺組織中XODǎeNOSǎNADPH氧化酶P22phoxǎP67phox的表達上調(diào)，CYP2J2基因過表達顯著抑制了肺缺血再灌注后XOD，eNOS，NADPH氧化酶P22phoxǎP67phox表達的上調(diào) 6. Western blot檢測結(jié)果顯示：左肺缺血再灌注損傷導(dǎo)致大鼠肺組織內(nèi)PI3Kǎp-Akt的表達顯著下調(diào)，而CYP2J2過表達的IR+2J2組PI3Kǎp-Akt的表達較IR組和IR+GFP組明顯升高，但仍然低于未發(fā)生缺血再灌注損傷的Blank組和Sham組 左肺缺血再灌注損傷導(dǎo)致大鼠肺組織內(nèi)NF-κB的表達顯著上調(diào)，而CYP2J2過表達的IR+2J2組NF-κB的表達較IR組和IR+GFP組明顯降低，但仍然高于未發(fā)生缺血再灌注損傷的Blank組和Sham組 7.左肺缺血再灌注可使心率明顯減慢，CYP2J2基因過表達對大鼠缺血再灌注后心率減慢無顯著影響；IR組ǎIR+GFP組及IR+2J2組大鼠右心室收縮壓（RVSP）明顯低于Blank組和Sham組（P0.01），IR+2J2組RVSP顯著高于IR組與IR+GFP組（P0.05）；IR+2J2組右心室舒張期末壓力（RVEDP）顯著低于其余四組大鼠（P0.05）；IR組ǎIR+GFP組及IR+2J2組大鼠右心室等容收縮期室內(nèi)壓上升最大速率（RV+dp/dt max，mmHg/s）ǎ右心室等容舒張期室內(nèi)壓下降最大速率（RV-dp/dt max，mmHg/s）明顯低于Blank組及Sham組（P0.01），IR+2J2組±dp/dt max顯著高于IR組和IR+GFP組（P0.05） 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較兩組間差別計量資料用均數(shù)±標準差（x SD）進行統(tǒng)計學(xué)描述，采用均數(shù)t檢驗和單因素方差分析（ANOVA）比較兩組組內(nèi)ǎ組間的差別所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義 結(jié)論 1.成功構(gòu)建了Wister大鼠在體左肺缺血再灌注損傷的動物模型 2.通過尾靜脈注射質(zhì)粒的方法，成功在Wister大鼠體內(nèi)表達CYP2J2基因，并將花生四烯酸代謝為EETs，發(fā)揮生物學(xué)作用 3. CYP2J2基因過表達顯著減少細胞凋亡，減輕了大鼠左肺缺血再灌注損傷 4. CYP2J2基因過表達明顯改善了左肺缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的大鼠右心室收縮和舒張功能的損害 5. CYP2J2基因過表達明顯抑制了左肺缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的血清促炎癥因子及趨化因子水平的升高 6. CYP2J2基因過表達明顯抑制了左肺缺血再灌注所導(dǎo)致的促氧化應(yīng)激相關(guān)指標的升高，抑制了促氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達 7. CYP2J2基因抗炎癥和抑制氧化應(yīng)激的作用可能和PI3K/AKT/NF-κB信號通路有關(guān)
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R450;R563

【參考文獻】

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本文編號：2209403