【摘要】：背景和目的： 急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratorydistress syndrome，ARDS）是各種致病因素導(dǎo)致的急性進行性呼吸衰竭，其最常見的致病因素為肺部感染。國內(nèi)外學(xué)者對ARDS的治療進行了大量的研究并取得了一定的進展，但并不能從根本上改善不良預(yù)后，其死亡率仍高達40%。 骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為一種多潛能干細胞，取材方便，易于分離擴增，且能免疫耐受并能轉(zhuǎn)染和長期表達外源性基因，是理想的組織修復(fù)來源和基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定載體，因而其在ARDS/ALI治療中具有重要的應(yīng)用價值。 角質(zhì)細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）是成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)家族的第7位成員，具有促進上皮細胞有絲分裂、調(diào)控細胞分化、抗凋亡及促進表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白（surfactant-associatedprotein，SP）的合成等作用，在ALI的治療研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究旨在觀察KGF基因修飾的間充質(zhì)干細胞回輸體內(nèi)對內(nèi)毒素（lipopolysaccharide, LPS）所致的肺損傷模型的生物學(xué)作用并探討其相關(guān)的機制，，為ALI的治療提供一種新的具有突破性的實驗線索。 方法和結(jié)果 采用全骨髓貼壁法分離MSCs，培養(yǎng)和擴增至第四代，經(jīng)流式細胞儀和分化鑒定，得到純度較高的MSCs。同時構(gòu)建KGF重組質(zhì)粒感染293T細胞，濃縮純化后收集病毒顆粒，再分別感染小鼠MSCs，熒光顯微鏡觀察兩組感染效率均達90%，經(jīng)real-time定量PCR法和Western-blot法分析KGF基因表達良好。經(jīng)小鼠氣管內(nèi)滴注LPS10mg/kg成功構(gòu)建ALI模型后，160只ALI模型小鼠隨機分為生理鹽水對照組(NS組)、單純MSCs對照組（MSCs組）、MSCs空載對照組（MSCs-vec組）和攜帶KGF的MSCs實驗組（MSCs-KGF組）。結(jié)果顯示：與對照組相比，MSCs可定植于肺組織內(nèi)；在24h和3d時間點，MSCs-KGF實驗組KGF的RNA和蛋白質(zhì)在體內(nèi)表達明顯增高（P0.05），同時對降低肺濕干比、BALF中總蛋白含量、BALF中中性粒細胞數(shù)量及肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），而且顯著降低了BALF中促炎因子水平而升高了抗炎因子水平。MSCs-KGF實驗組肺組織病理切片的病變程度輕于對照組，病理評分有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。另取40只小鼠隨機分為上述4組單獨測生存率，結(jié)果提示其對改善生存率有一定優(yōu)勢（P0.05）。同時MSCs-KGF實驗組SPB和SPC的mRNA水平與對照組比較明顯增加（P0.05）,免疫組化示MSCs-KGF實驗組PCNA陽性的細胞較對照組增多。 結(jié)論： 1.運用全骨髓貼壁法能成功從小鼠骨髓中分離MSCs，并可在體外培養(yǎng)擴增。 2. KGF慢病毒載體能感染MSCs，并能高效率、長時間在MSCs內(nèi)穩(wěn)定表達KGF，MSCs是良好的基因治療運載工具。 3. KGF基因修飾的MSCs移植后可歸巢到受損肺組織，并能在肺內(nèi)高表達KGF； 4. KGF與MSCs發(fā)揮協(xié)同作用，可改善肺血管滲透性，抑制肺組織的炎癥反應(yīng)，減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷病變嚴(yán)重程度，并且具有提高ALI動物生存率的趨勢，從而為ALI的基因治療提供了實驗依據(jù)。 5. KGF發(fā)揮作用的潛在機制可能與KGF刺激SP分泌及促進有絲分裂有關(guān)。
[Abstract]:Background and purpose:
Acute lung injury (acute lung injury, ALI) and acute respiratory distress syndrome (acute respiratorydistress syndrome, ARDS) are acute progressive respiratory failure caused by various pathogenic factors. The most common pathogenic factor is pulmonary infection. The domestic and foreign scholars have made a great deal of research on the treatment of ARDS and have made certain progress, but they have made some progress. It can not fundamentally improve the poor prognosis, the mortality rate is still as high as 40%.
Mesenchymal stem cells (MSCs), as a kind of pluripotent stem cells, is a kind of pluripotent stem cells, which is convenient, easy to be separated and amplified, and can be immune tolerance and can be transfected and long expressed exogenous genes. It is an ideal source of tissue repair and a stable carrier of gene transfection. Therefore, it has important application value in the treatment of ARDS/ALI.
Keratinocyte growth factor (KGF) is the seventh member of the fibroblast growth factor (fibroblast growth factor, FGF) family, which has the role of promoting mitosis in epithelial cells, regulating cell differentiation, anti apoptosis and promoting the synthesis of surfactant junction protein (surfactant-associatedprotein, SP). The therapeutic research of ALI has a broad application prospect.
The purpose of this study is to observe the biological effects of KGF gene modified mesenchymal stem cells on the model of lung injury induced by lipopolysaccharide (LPS) and explore its related mechanisms, providing a new and breakthrough experimental clue for the treatment of ALI.
Methods and results
The total bone marrow adherent method was used to isolate MSCs and be cultured and amplified to fourth generations. By flow cytometry and differentiation, the high purity MSCs. was obtained and KGF recombinant plasmid was constructed to infect 293T cells. After concentration and purification, the virus particles were collected and then infected with MSCs in mice respectively. The infection efficiency of the two groups was 90%, and PCR was quantified by real-time PCR. The expression of KGF gene was well expressed by method and Western-blot method. After the successful construction of ALI model by intratracheal infusion of LPS10mg/kg in mice, 160 ALI mice were randomly divided into normal saline control group (NS group), pure MSCs control group (MSCs group), MSCs empty control group (MSCs-vec group) and KGF MSCs experimental group (Group). The results showed that the control group was compared with the control group. Compared with the group, MSCs could be colonized in the lung tissue. In the time point of 24h and 3D, the expression of RNA and protein in KGF was significantly increased in the MSCs-KGF experimental group (P0.05), and the total protein content in BALF, the amount of neutrophils in BALF and the activity of myeloperoxidase (MPO) in lung tissue were statistically significant (P0.05), and significantly decreased. The degree of pathological section of lung tissue in the.MSCs-KGF experimental group of BALF was higher than that of the control group, and the pathological score of the lung tissue was less than that of the control group, and the pathological score was statistically significant (P0.05). The other 40 mice were randomly divided into 4 groups, and the results showed that they had some advantages (P0.05) for the improvement of survival rate (P0.05). At the same time, MSCs-KGF was true. The levels of SPB and SPC mRNA in the test group were significantly higher than those in the control group (P 0.05). The number of PCNA positive cells in the MSCs-KGF test group was higher than that in the control group by immunohistochemistry.
Conclusion:
1. MSCs can be successfully isolated from mouse bone marrow by whole bone marrow adherent method and can be amplified in vitro.
2. KGF lentiviral vector can infect MSCs with high efficiency. It can stably express KGF in MSCs for a long time. MSCs is a good carrier for gene therapy.
3. KGF gene modified MSCs can homing to damaged lung tissue and express KGF in lung.
4. KGF and MSCs play a synergistic effect, which can improve pulmonary vascular permeability, inhibit the inflammatory response of lung tissue, reduce the severity of acute lung injury induced by endotoxin, and have a tendency to increase the survival rate of ALI animals, thus providing experimental basis for the gene therapy of ALI.
5. the underlying mechanism of KGF may be related to KGF stimulating SP secretion and promoting mitosis.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R563.8

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本文編號：2156813