本文關(guān)鍵詞：細胞自噬在OVA和HDM誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《浙江大學》 2015年

細胞自噬在OVA和HDM誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及機制

趙昀  

【摘要】：支氣管哮喘(簡稱哮喘),是最常見的氣道慢性炎癥性疾病之一,嚴重威脅著人類的健康。目前全世界約有3億哮喘患者,其中中國有3千萬左右,雖然發(fā)病率不高,但是病死率卻居高不下。哮喘是以嗜酸性粒細胞,肥大細胞,T淋巴細胞等氣道局部浸潤為主,主要表現(xiàn)為氣道高反應性,粘液高分泌和可逆性的氣流受限。傳統(tǒng)的變態(tài)反應型哮喘氣道炎癥主要表現(xiàn)為2型輔助性T(Th)細胞、嗜酸性粒細胞和激活的肥大細胞的增多以及Th2型細胞因子(IL-4、IL-5和IL-13等)的大量分泌。近年來一些研究表明一些新的細胞類型如TH17細胞,Treg細胞,DC細胞等,新型的細胞因子如IL-25, IL-33, TSLP在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,然而哮喘發(fā)病的分子學機制至今仍未完全闡明。 細胞自噬是機體一種重要的保護和防御機制,在機體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和適應微環(huán)境改變的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在某些特定的環(huán)境(如饑餓,生長因子缺乏,缺氧)下,細胞內(nèi)可以形成一種雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu),該囊泡結(jié)構(gòu)可以捕獲細胞內(nèi)受損的細胞器(如線粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體等)和變性的蛋白質(zhì),形成細胞自噬體,然后細胞自噬體可以與細胞內(nèi)的溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體,進而在溶酶體內(nèi)各種水解酶的作用下,將其內(nèi)的細胞器和生物大分子消化降解,從而為新的生物大分子合成提供原料和能量。細胞自噬過程(包括細胞自噬體的形成,細胞自噬體捕獲受損的細胞器和生物大分子的過程)受多種分子調(diào)控,這些分子統(tǒng)稱為Atg (autophagy-related)家族。其中Beclin-1(又稱為Atg6)在細胞自噬體形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,而LC3B(Atg8的同源蛋白)則在細胞自噬體捕獲受損細胞器和生物大分子的過程中非常重要,脂質(zhì)化的LC3BⅡ與LC3B本體LC3BI的比例已經(jīng)被公認為是WesternBlot檢測細胞自噬的金標準。除此之外,目前已發(fā)現(xiàn)30種以上的Atg基因和蛋白與細胞自噬的分子機制有關(guān)。 雖然細胞自噬有利于維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,但是,在特定的情況下,細胞內(nèi)大量細胞器和生物大分子的消耗會導致其死亡,稱之為細胞自噬死亡。所以在不同的情況下,細胞自噬可以保護細胞,也可以促進細胞死亡,因此在不同疾病的發(fā)病過程中細胞自噬發(fā)揮著不同的作用。目前越來越多的研究證明細胞自噬在多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中有重要的調(diào)控作用,如慢性阻塞性肺疾病(COPD),肺動脈高壓,急性肺損傷,囊性纖維病等,然而,關(guān)于細胞自噬在支氣管哮喘發(fā)病過程中的作用卻鮮有研究報導。 本實驗分兩部分進行研究：(1)利用細胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠LC3B-/-構(gòu)建OVA誘導的哮喘氣道炎癥模型闡明細胞自噬在OVA誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及其機制；(2)利用細胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠LC3B-/-構(gòu)建HDM誘導的哮喘氣道炎癥模型闡明細胞自噬在HDM誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用,并通過骨髓移植技術(shù)探究細胞自噬在HDM誘導的哮喘氣道炎癥中的作用機制。 第一部分細胞自噬在OVA誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及機制 目的：研究細胞自噬在OVA誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及其機制。 方法：健康的雄性C57BL/6小鼠,相同周齡的雄性LC3B-/-小鼠,分別隨機分為生理鹽水對照組(WT/NS和LC3B/NS)和哮喘模型組(WT/OVA和LC3B/OVA).哮喘模型組以卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘模型生理鹽水對照組則以同等劑量的生理鹽水代替OVA,于最后一次OVA激發(fā)后24小時后處理小鼠,檢測其肺泡灌洗液內(nèi)炎癥細胞的總數(shù),嗜酸性粒細胞比例及絕對值,肺組織HE染色觀察氣道炎癥浸潤的情況,PAS染色觀察粘液的分泌情況,肺組織mRNA檢測一些炎癥因子的表達,ELISA檢測肺泡灌洗液內(nèi)炎癥因子的分泌。體外利用IL-13干預人肺上皮細胞BEASE-2B, Q-PCR檢測IL-25分泌的變化,。OVA干預人氣道上皮細胞HBE, Western Blot檢測LC3B表達的變化。 結(jié)果：LC3B敲除后明顯緩解OVA誘導的哮喘氣道炎癥,肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù),嗜酸性粒細胞比例和絕對值都明顯減少,肺部炎癥浸潤明顯緩解,粘液分泌明顯下調(diào),肺泡灌洗液中炎癥因子的分泌,肺組織炎癥因子的表達也明顯下降。體外IL-13干預人氣道上皮細胞BEASE-2B均能誘導IL-25表達的增加,然而敲除自噬相關(guān)基因之后IL-25的表達則會明顯下調(diào)。且OVA干預人氣道上皮細胞HBE可以明顯誘導LC3B表達的增加。 結(jié)論：細胞自噬相關(guān)基因LC3B敲除可以緩解OVA誘導的小鼠氣道炎癥,可能是通過抑制IL-25,IL-33等炎癥因子的分泌從而減輕氣道上皮細胞損傷實現(xiàn)的。 第二部分細胞自噬在HDM誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用 目的：研究細胞自噬在OVA誘導的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用。方法：健康的雄性C57BL/6小鼠,相同周齡的雄性LC3B-/-小鼠,分別隨機分為生理鹽水對照組(WT/NS和LC3B/NS)和哮喘模型組(WT/HDM和LC3B/HDM)。哮喘模型組以氣道滴注塵螨提取物(HDM)致敏和激發(fā)建立哮喘模型,生理鹽水對照組則以同等劑量的生理鹽水代替HDM。于最后一次HDM激發(fā)后48小時后處理小鼠,檢測其肺泡灌洗液內(nèi)炎癥細胞的總數(shù),嗜酸性粒細胞比例及絕對值,肺組織mRNA檢測一些炎癥因子的表達,ELISA檢測肺泡灌洗液內(nèi)炎癥因子的分泌。建立骨髓移植模型,將LC3B-/-骨髓移植到WT小鼠體內(nèi),觀察骨髓內(nèi)敲除LC3B對哮喘表型是否有影響。然后將WT骨髓回輸?shù)絃C3B-/-小鼠體內(nèi),觀察對于LC3B-/-小鼠的哮喘表型是否有一定的“挽救”作用。 結(jié)果：LC3B敲除后明顯緩解HDM誘導的哮喘氣道炎癥,肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù),嗜酸性粒細胞比例和絕對值都明顯減少,肺泡灌洗液中炎癥因子的分泌,肺組織炎癥因子的表達也明顯下降。將LC3B-/-小鼠骨髓移植到WT小鼠體內(nèi)(相當于骨髓特異性敲除LC3B),對HDM誘導的哮喘氣道炎癥有一定的緩解作用；然而將WT-小鼠骨髓移植到LC3B-/-小鼠體內(nèi),對于LC3B-/-小鼠的表型并沒有明顯的“挽救”作用。 結(jié)論：細胞自噬相關(guān)基因LC3B敲除可以緩解HDM誘導的小鼠氣道炎癥,其調(diào)控作用主要在氣道上皮細胞層面,不依賴于骨髓。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R562.25
【目錄】：

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