本文關(guān)鍵詞：肺泡巨噬細(xì)胞在過(guò)敏性哮喘中發(fā)揮作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《泰山醫(yī)學(xué)院》 2014年

肺泡巨噬細(xì)胞在過(guò)敏性哮喘中發(fā)揮作用的初步研究

黃華  

【摘要】：目的 以雞卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）與免疫佐劑明礬（Aluminium hydroxide,ALUM）來(lái)腹腔致敏小鼠，并聯(lián)合OVA霧化誘導(dǎo)小鼠過(guò)敏性哮喘，研究肺臟中肺泡巨噬細(xì)胞(AM)在過(guò)敏性哮喘中發(fā)揮的作用。 以C57BL/6小鼠及相關(guān)轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立小鼠哮喘模型，，主要以CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因的嵌合小鼠氣管內(nèi)注射白喉毒素（Diphtheria toxin，DT）清除肺臟中的肺泡巨噬細(xì)胞（AM）與樹(shù)突狀細(xì)胞亞群(DCs)，來(lái)研究肺臟中肺泡巨噬細(xì)胞在過(guò)敏性哮喘中的作用機(jī)制。本論文目前主要以細(xì)胞與分子免疫學(xué)、免疫熒光及免疫組織化學(xué)方法為核心技術(shù)，研究在過(guò)敏性哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，天然免疫水平上肺中AM與DCs的變化，以及肺臟中AM與DCs對(duì)獲得性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性功能的變化，以明確其可能的作用機(jī)制。為探索過(guò)敏性哮喘等呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制、研制預(yù)防、治療過(guò)敏的藥物及方法提供理論依據(jù)。 方法 首先，選用雌性6-8周的C57BL/6小鼠，以免疫佐劑明礬（alum）混加入雞卵清蛋白（OVA），震蕩混勻充分乳化OVA后，對(duì)小鼠腹腔注射做初次致敏免疫，14天后再次相同劑量進(jìn)行第二次致敏免疫。在第二次腹腔致敏后，用OVA在28-30連續(xù)霧化3天，每次30min，建立小鼠過(guò)敏性哮喘模型。 其次，聯(lián)合應(yīng)用相關(guān)轉(zhuǎn)基因和基因敲除純合小鼠及其嵌合小鼠建立哮喘模型。對(duì)CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠頸椎脫臼處死，取其骨髓制單細(xì)胞懸液，尾靜脈回輸?shù)捷椪蘸蟮南鄳?yīng)小鼠，制造CD11c-DTR嵌合鼠，并且8周后檢測(cè)嵌合情況，建立CD11c-DTR嵌合小鼠過(guò)敏性哮喘模型。 最后，各組小鼠最后一次霧化24小時(shí)后，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，取支氣管肺泡灌洗液、肺臟、肺引流淋巴結(jié)、脾臟等；以ELISA的方法檢測(cè)血清和灌洗液中IL4、IgG1、IgG2b等的表達(dá)水平；以Real-time PCR檢測(cè)肺組織及其引流淋巴結(jié)中細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平；以FACS Aria II的含9色流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)的樹(shù)突狀細(xì)胞亞群（DCs）、肺泡巨噬細(xì)胞(AM)、淋巴細(xì)胞亞群及其相關(guān)的胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平；對(duì)肺部組織切片進(jìn)行HE、PAS，觀察肺部組織形態(tài)、肺部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)狀態(tài)的變化情況。 結(jié)果 C57BL/6小鼠哮喘模型，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)支氣管肺灌洗液以及肺部單細(xì)胞懸液的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)所占比例，OVA+ALUM組＞PBS組。AM、DC所占比例，均呈OVA+ALUM組＞PBS組。肺部切片HE/PAS染色，OVA+ALUM組較PBS組肺部呼吸道周圍炎癥細(xì)胞募集浸潤(rùn)程度以及氣道粘液分泌程度要嚴(yán)重。ELISA檢測(cè)血清發(fā)現(xiàn)IgG1的表達(dá)OVA+ALUM組＞PBS組，而IgG2b無(wú)差異。從而證明OVA+ALUM腹腔致敏并且OVA霧化組肺部炎癥狀態(tài)較為嚴(yán)重，明顯高于PBS陰性對(duì)照組。CD103+CD11b-DCs在過(guò)敏原激發(fā)后的肺部會(huì)大量募集，且CD4+T大量增殖。 CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因嵌合小鼠氣管內(nèi)注射白喉毒素（DT）效果相對(duì)穩(wěn)定，注射DT后，主要清除CD103+DC亞群和肺泡巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步研究DC和肺泡巨噬細(xì)胞清除后的回歸規(guī)律發(fā)現(xiàn)DC比AM早約4天回歸。 CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因嵌合小鼠哮喘模型，氣管內(nèi)注射DT組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)支氣管肺灌洗液以及肺部單細(xì)胞懸液的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)所占比例較OVA+ALUM組明顯下降，肺部切片HE/PAS染色，較OVA+ALUM組呼吸道周圍炎癥細(xì)胞募集浸潤(rùn)程度以及氣道粘液分泌程度明顯減輕，從而證明DT組肺臟內(nèi)在清除AM以及DC后會(huì)導(dǎo)致肺部炎癥明顯下降，CD4+T增殖明顯降低；而在肺泡巨噬細(xì)胞被大量清除，DC已經(jīng)完全回歸的情況下，肺部雖存在炎癥，但較OVA+ALUM組相對(duì)較輕。 結(jié)論 1、明確了肺部樹(shù)突狀細(xì)胞與肺泡巨噬細(xì)胞的分析策略，成功建立哮喘小鼠模型； 2、CD103+DCs與過(guò)敏性哮喘肺部炎癥過(guò)程中的TH2分化相關(guān)； 3、DT清除肺部樹(shù)突狀細(xì)胞與肺泡巨噬細(xì)胞后，DC早AM約4天回歸； 4、肺泡巨噬細(xì)胞在過(guò)敏性哮喘的肺部炎癥過(guò)程中有促進(jìn)炎癥作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

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