本文選題：青蒿琥酯 + TGF-β1��； 參考：《桂林醫(yī)學(xué)院》2013年碩士論文

【摘要】：目的：特發(fā)性肺纖維化是以間充質(zhì)細胞增生和細胞外基質(zhì)異常沉積為特點的漸進性疾病，正常肺組織主要由肺泡上皮細胞組成，肺泡上皮細胞分Ⅰ型和Ⅱ型。肺泡Ⅱ型上皮細胞有干細胞特性，可在細胞因子TGF-β1的作用下轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細胞（EMT），表達間質(zhì)細胞表型標志物肌動蛋白（ACTA2）和V-波形蛋白(Vim)，從而加快肺纖維化進程，其可能機制為活化TGF-β1底物Smad、P38MAPK。青蒿琥酯為傳統(tǒng)的抗瘧疾藥，前期研究證實其有抗纖維化作用。本研究擬用青蒿琥酯為工具藥，探討在青蒿琥酯作用下對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程的影響及其可能機制，從而研究青蒿琥酯與肺纖維化的關(guān)系。 方法：實驗分兩部分。第一部分研究青蒿琥酯對TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化過程中TGF-β1/smad通路影響的劑量效應(yīng)及時間效應(yīng)：體外培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞（RLE-6TN）；預(yù)實驗檢測TGF-β1誘導(dǎo)濃度；MTT法檢測青蒿琥酯作用于TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細胞12小時、24小時、48小時后的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），根據(jù)IC50選擇青蒿琥酯干預(yù)濃度；細胞分6組（劑量效應(yīng)），①空白組；②TGF-β1（3ng/ml）組；③TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(1ug/ml)組；④TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(2ug/ml)組；⑤TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(4ug/ml)組；⑥TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(8ug/ml)組，培養(yǎng)24小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；收集細胞，提取總RNA，RT-PCR法檢測各組Smad3、Smad7、ACTA2、Vim的mRNA表達情況；提取總蛋白，Western bloting法檢測各組P-Smad3、Smad7、ACTA2、Vim蛋白表達情況；細胞分成4組（時間效應(yīng)），①空白組（1%FBS）；②TGF-β組（3ng/ml）；③TGF-β（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯（1ug/ml）組；④青蒿琥酯組（1ug/ml），培養(yǎng)12、24、48小時后；收集細胞，提取總RNA， RT-PCR法檢測各組Smad3、Smad7、ACTA2、Vim的mRNA表達情況；培養(yǎng)24小時后，提取總蛋白，Western bloting法檢測各組P-Smad3、Smad7、ACTA2、Vim蛋白表達情況。 第二部分研究不同劑量的青蒿琥酯對TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化過程中TGF-β1/P38MAPK通路的影響：體外培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞（RLE-6TN）；細胞分6組，①空白組；②TGF-β1（3ng/ml）組；③TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(1ug/ml)組；④TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(2ug/ml)組；⑤TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(4ug/ml)組；⑥TGF-β1（3ng/ml）聯(lián)合青蒿琥酯(8ug/ml)組，培養(yǎng)24小時后，收集細胞，提取總RNA，RT-PCR法檢測各組P38MAPK、ACTA2、Vim mRNA表達情況；提取總蛋白，Western bloting法檢測各組P38MAPK、ACTA2、Vim蛋白表達情況。 結(jié)果：第一部分：青蒿琥酯作用于TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細胞12小時后無抑制作用，24小時后的IC50為8.86ug/ml，48小時IC50為5.04ug/ml；鏡下觀察結(jié)果示與正常組相比，TGF-β1組RLE-6TN細胞由鋪路石狀上皮形態(tài)變成梭形、紡錘形，而且其細胞間隙略變大，青蒿琥酯作用于TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細胞24小時后，與TGF-β1組比較，細胞的梭形結(jié)構(gòu)減少，部分恢復(fù)鋪路石狀上皮形態(tài)，但細胞之間連接仍松散，其中TGF-β1聯(lián)合青蒿琥酯1ug/ml組表現(xiàn)最明顯；RT-PCR及Western bloting結(jié)果示與空白組比較，TGF-β1組Smad3、Smad7、ACTA2、Vim mRNA及蛋白均表達增加（P0.05）；與TGF-β1組比較，，TGF-β1聯(lián)合青蒿琥酯組Smad7mRNA及蛋白均表達增加（P0.05）；Smad3、ACTA2、VimmRNA表達降低（P0.05），P-Smad3、ACTA2、Vim蛋白表達降低（P0.05），作用劑量為1ug/ml，作用24小時表達最明顯。 第二部分：RT-PCR及Western bloting結(jié)果示與空白組比較，TGF-β1組P38MAPK、ACTA2、Vim mRNA及蛋白均表達增加（P0.05）；與TGF-β1組比較，P38MAPK、ACTA2、Vim mRNA及蛋白均表達降低（P0.05）。 結(jié)論：1.TGF-β1可誘導(dǎo)肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細胞（EMT）。 2.青蒿琥酯可在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程，其可能機制為上調(diào)Smad7mRNA及蛋白表達，下調(diào)Smad3、P38MAPK mRNA及蛋白的表達，抑制Smad3蛋白磷酸化。 3.青蒿琥酯具有抗纖維化作用，其可能機制為抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程。
[Abstract]:Objective : Idiopathic pulmonary fibrosis is a progressive disease characterized by the abnormal deposition of mesenchymal cell hyperplasia and extracellular matrix . The normal lung tissue consists of alveolar epithelial cells . The alveolar epithelial cells are classified as type 鈪

本文編號：2035646