本文選題：氣道平滑肌細(xì)胞 + 透明質(zhì)酸��； 參考：《華中科技大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：第一部分 透明質(zhì)酸與其受體CD44在慢性哮喘ASMCs中的表達(dá)變化 研究目的 1、研究SD大鼠在慢性哮喘狀態(tài)下，氣道平滑肌細(xì)胞分泌的透明質(zhì)酸（hyaluronicacid）的表達(dá)，以及其受體CD44基因和蛋白水平的表達(dá)。 2、研究SD大鼠在慢性哮喘狀態(tài)下，氣道平滑肌細(xì)胞中透明質(zhì)酸合成酶（HAS）和透明質(zhì)酸酶（HYAL）基因水平的表達(dá)。 材料與方法 建立SD大鼠慢性哮喘模型，處死后培養(yǎng)原代氣道平滑肌細(xì)胞，使用2~5代ASMCs。 分組：正常對照組（C組）和慢性哮喘組（A組）。 應(yīng)用realtime PCR檢測ASMCs中CD44,透明質(zhì)酸合酶1、2、3和透明質(zhì)酸酶1、 2基因水平變化；Elisa方法檢測ASMCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HA的含量；Western-blot方法檢測ASMCs中CD44蛋白水平的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、慢性哮喘組大鼠ASMCs中CD44mRNA和蛋白水平表達(dá)較正常對照組明顯升高（p＜0.05）。 2、慢性哮喘組大鼠ASMCs分泌的HA較正常對照組明顯升高（p＜0.001）。 3、相對于正常對照組，慢性哮喘組大鼠ASMCs中透明質(zhì)酸合酶1、2及透明質(zhì)酸酶1、2mRNA表達(dá)均升高（p＜0.05）。 結(jié)論 與正常對照組相比，慢性哮喘氣道平滑肌細(xì)胞分泌的HA以及細(xì)胞膜上其受體CD44表達(dá)明顯增高，透明質(zhì)酸合酶以及透明質(zhì)酸酶mRNA水平表達(dá)明顯增高。 第二部分透明質(zhì)酸對SD大鼠慢性哮喘模型氣道平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 研究目的 1、研究SD大鼠在慢性哮喘狀態(tài)下，氣道平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的表達(dá)。 2、研究SD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞在低分子量透明質(zhì)酸（LMH-HA）干預(yù)下，其細(xì)胞學(xué)活性的表達(dá)變化。 3、研究SD大鼠在慢性哮喘狀態(tài)下，氣道平滑肌細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2）與磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表達(dá)和活化情況。 4、研究SD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞在低分子量透明質(zhì)酸（LMH-HA）干預(yù)下，氣道平滑肌細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2）與磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表達(dá)和活化情況。 材料與方法 慢性哮喘模型制備，原代ASMCs培養(yǎng)與第一部分相同。 實(shí)驗(yàn)分組： （1）正常對照組（C組）：即為正常對照組大鼠ASMCs，無任何刺激干預(yù)； （2）對照+低分子量透明質(zhì)酸組（C+HA組）：正常對照組大鼠ASMCs加入1mg/L低分子量透明質(zhì)酸刺激24小時(shí)； （3）對照+低分子量透明質(zhì)酸+PD98059組（C+HA+PD98059組）：正常對照組大鼠ASMCs先加入10umol/L PD98059干預(yù)1小時(shí)，再給予1mg/L低分子量透明質(zhì)酸刺激24小時(shí)； （4）慢性哮喘組（A組）：即為慢性哮喘組大鼠ASMCs，不加任何干預(yù)刺激； （5）慢性哮喘+低分子量透明質(zhì)酸組（A+HA組）：慢性哮喘組大鼠ASMCs加入1mg/L低分子量透明質(zhì)酸刺激24小時(shí)； （6）慢性哮喘+低分子量透明質(zhì)酸+PD98059組（A+HA+PD98059組）：慢性哮喘組大鼠ASMCs先加入10umol/L PD98059干預(yù)1小時(shí)，再給予1mg/L低分子量透明質(zhì)酸刺激24小時(shí)。 應(yīng)用Western-blot方法檢測各組ASMCs中p-ERK1/2、ERK1/2蛋白水平的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)、MTT法檢測各組ASMCs增殖和凋亡改變。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、對比正常對照組，慢性哮喘組大鼠ASMCs增殖水平升高，凋亡水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。 2、正常對照組和哮喘對照組大鼠ASMCs經(jīng)LMW-HA干預(yù)后，細(xì)胞增殖均較對照組明顯增加（p＜0.01）；并且ASMCs經(jīng)PD98059阻斷后加入LMW-HA干預(yù)，細(xì)胞增殖較對照組以及LMW-HA干預(yù)組降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。 3、正常對照組和哮喘對照組大鼠ASMCs經(jīng)LMW-HA干預(yù)后，，細(xì)胞凋亡較對照組均減少（p＜0.05）；并且ASMCs經(jīng)PD98059阻斷后加入LMW-HA干預(yù)，細(xì)胞凋亡較對照組以及LMW-HA干預(yù)組增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。 4、對照組ASMCs經(jīng)LMW-HA干預(yù)后，p-ERK1/2、ERK1/2蛋白水平以及p-ERK1/2、ERK1/2活性比值較對照組升高（p＜0.05）。對照組ASMCs經(jīng)PD98059阻斷再加入LMW-HA干預(yù)后，p-ERK1/2、ERK1/2活性比值較對照組以及LMW-HA干預(yù)組顯著降低（p＜0.05）。 結(jié)論 在慢性哮喘狀態(tài)下，ASMCs增殖較正常對照組顯著增加，同時(shí)凋亡水平明顯降低；ASMCs在低分子量透明質(zhì)酸（LMH-HA）干預(yù)下，增殖活性顯著增高，凋亡減少，并且這一過程是通過ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。以上結(jié)果提示，在慢性哮喘狀態(tài)下，氣道平滑肌細(xì)胞向中細(xì)胞外基質(zhì)中分泌的HA升高，而ECM中升高的HA和CD44又通過ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)ASMCs的異常增殖，從而參與慢性哮喘氣道重塑過程。
[Abstract]:Part one
Expression of hyaluronic acid and its receptor CD44 in chronic asthma ASMCs
research objective
1, to investigate the expression of hyaluronic acid (hyaluronicacid) secreted by airway smooth muscle cells in SD rats and the expression of CD44 gene and protein level of its receptor.
2, we studied the expression of hyaluronan synthase (HAS) and hyaluronidase (HYAL) gene in airway smooth muscle cells of SD rats in chronic asthma.
Materials and methods
A SD rat model of chronic asthma was established, and the primary airway smooth muscle cells were cultured after death. The 2~5 generation ASMCs. was used.
Group: normal control group (group C) and chronic asthma group (group A).
Realtime PCR was used to detect CD44, hyaluronan synthase 1,2,3 and hyaluronidase 1 in ASMCs.
2 changes in gene level; Elisa method was used to detect the content of HA in ASMCs cell culture supernatant; Western-blot method was used to detect the expression of CD44 protein in ASMCs.
experimental result
1, the expression of CD44mRNA and protein in ASMCs of chronic asthma group was significantly higher than that of normal control group (P < 0.05).
2, the HA secretion of ASMCs in chronic asthma group was significantly higher than that in normal control group (P < 0.001).
3, compared with normal control group, the expression of hyaluronan synthase 1,2 and hyaluronidase 1,2mRNA in ASMCs of chronic asthma group increased (P < 0.05).
conclusion
Compared with the normal control group, the expression of HA and the expression of CD44 on the cell membrane of the airway smooth muscle cells increased significantly, and the expression of hyaluronidase and hyaluronidase mRNA increased significantly.
The second part is the effect of hyaluronic acid on the proliferation and apoptosis of airway smooth muscle cells in chronic asthmatic model of SD rats.
research objective
1, we studied the expression of airway smooth muscle cell proliferation and apoptosis in SD rats under chronic asthma.
2, we studied the changes of cellular activity of SD rat airway smooth muscle cells under the intervention of low molecular weight hyaluronic acid (LMH-HA).
3, the expression and activation of extracellular signal regulated kinase 1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2) and phosphorylated extracellular signal regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) protein in the airway smooth muscle cells of SD rats were studied in the condition of chronic asthma.
4, the expression and activation of the extracellular signal regulated kinase 1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2) and phosphorylated extracellular signal regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) in the airway smooth muscle cells in the airway smooth muscle cells of SD rats were studied under the intervention of low molecular weight hyaluronic acid (LMH-HA).
Materials and methods
The chronic asthma model was prepared, and the primary ASMCs culture was the same as that in the first part.
Group of experiments:
(1) normal control group (group C): the normal control group rats were ASMCs without any stimulation intervention.
(2) control + low molecular weight hyaluronic acid group (group C+HA): in normal control rats, ASMCs was added to 1mg/L low molecular weight hyaluronic acid for 24 hours.
(3) control + low molecular weight hyaluronic acid +PD98059 group (group C+HA+PD98059): normal control group rats ASMCs first added 10umol/L PD98059 intervention for 1 hours, and then give 1mg/L low molecular weight hyaluronic acid stimulation for 24 hours.
(4) chronic asthma group (group A): chronic asthma group ASMCs, without any intervention stimulation;
(5) chronic asthma + low molecular weight hyaluronic acid group (group A+HA): in chronic asthma group, ASMCs was added to 1mg/L low molecular weight hyaluronic acid for 24 hours.
(6) chronic asthma + low molecular weight hyaluronic acid +PD98059 group (group A+HA+PD98059): chronic asthma group rats ASMCs first added 10umol/L PD98059 intervention for 1 hours, and then give 1mg/L low molecular weight hyaluronic acid stimulation for 24 hours.
Western-blot method was used to detect the expression of p-ERK1/2 and ERK1/2 protein in ASMCs of each group, and the proliferation and apoptosis of ASMCs in each group were detected by flow cytometry and MTT.
experimental result
1, compared with the normal control group, the level of ASMCs proliferation and the level of apoptosis were decreased in chronic asthma group, and the difference was statistically significant (P < 0.05).
2, the proliferation of ASMCs in the normal control group and the asthma control group was significantly higher than that in the control group (P < 0.01) after the intervention of LMW-HA (P < 0.01), and the proliferation of ASMCs was lower than that of the control group and the LMW-HA intervention group after PD98059 blockage, and the difference was statistically significant (P < 0.01).
3, in the normal control group and the asthma control group, the apoptosis of ASMCs was reduced by LMW-HA (P < 0.05) after the intervention of the control group (P < 0.05), and the apoptosis was increased after PD98059 blockage, and the apoptosis was increased compared with the control group and the LMW-HA intervention group, and the difference was statistically significant (P < 0.05).
4, compared with the control group, the ratio of p-ERK1/2, ERK1/2 protein and ERK1/2 activity was higher in the control group than in the control group (P < 0.05). The ratio of ASMCs to the control group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). The ratio of the activity of ASMCs to the control group was significantly lower than that of the control group and the intervention group (P < 0.05). The ratio of ASMCs to the control group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). (P < 0.05).
conclusion
In the state of chronic asthma, the proliferation of ASMCs was significantly higher than that in the normal control group, and the level of apoptosis was significantly reduced, and the proliferation activity of ASMCs was significantly increased and apoptosis decreased under the intervention of low molecular weight hyaluronic acid (LMH-HA). The process was realized through the ERK1/2 signal transduction pathway. The secreted HA of the smooth muscle cells increased to the medium extracellular matrix, while the increased HA and CD44 in ECM promoted the abnormal proliferation of ASMCs through the ERK1/2 signal transduction pathway, thus participating in the process of airway remodeling in chronic asthma.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R562.25

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本文編號(hào)：1909044