本文選題：哮喘 + 塵螨　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2013年博士論文

【摘要】：目前全球大約有3億人患哮喘,其中多數(shù)患者通過(guò)吸入免疫抑制劑(如糖皮質(zhì)激素)和p-腎上腺素受體激動(dòng)劑治療急性哮喘,獲得良好的效果。然而大約5%～10%的慢性哮喘患者卻對(duì)此類(lèi)治療反應(yīng)效果較差�；陬�(lèi)固醇拮抗型氣道炎癥嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康,且發(fā)病機(jī)制尚未明確,因此在此類(lèi)疾病的預(yù)防、診斷、治療上還存在很大的缺口,現(xiàn)有的部分臨床治療藥物也存在長(zhǎng)期的副作用或難吸收等各種各樣的問(wèn)題,研究類(lèi)固醇拮抗型氣道炎癥機(jī)制和開(kāi)發(fā)針對(duì)此類(lèi)疾病有效的藥物成為當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。本研究的目的是探索慢性氣道炎癥機(jī)制,并評(píng)價(jià)以Km(米氏常數(shù))原理高通量篩選的Syk激酶特異性抑制劑Vam3的抗炎機(jī)制,以期開(kāi)發(fā)出具有治療慢性氣道炎癥的一類(lèi)新藥。 大多數(shù)哮喘患者的致敏原為環(huán)境中的多種抗原,但在多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中只使用一種過(guò)敏原,不能反映患者發(fā)病機(jī)制的本質(zhì)。本研究通過(guò)采用患者常見(jiàn)的塵螨、豚草和曲霉菌屬組成的3類(lèi)過(guò)敏原復(fù)合物(DRA)免疫動(dòng)物,建立了慢性哮喘模型,并發(fā)現(xiàn)在慢性氣道炎癥中通過(guò)NF-κB影響炎癥因子IL-8表達(dá)與活性的作用機(jī)制。首先,將雌性BALB/c小鼠分為3組,模型組和藥物組中塵螨、豚草和曲霉菌屬(DRA)作為抗原,生理鹽水作為對(duì)照,重復(fù)免疫動(dòng)物10周。其次,藥物組中地塞米松作為治療藥物,對(duì)照組和模型組中生理鹽水作為安慰劑,口服灌胃兩周,每天1次。結(jié)果觀察到DRA增加了小鼠支氣管肺泡灌流(BAL)液中的IL-10、TGF-β水平和中性粒細(xì)胞在肺組織中募集。地塞米松降低了炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平,抑制了肺組織中肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)和粘液高分泌。但是,地塞米松并沒(méi)有降低反而增加了肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和與人類(lèi)功能同源的IL-8的水平。體外研究發(fā)現(xiàn),塵螨主要抗原組分Der p1可刺激人肺泡上皮A549細(xì)胞,增強(qiáng)了IL-8的基因表達(dá)和NF-κB的活性。然而,未見(jiàn)地塞米松抑制A549細(xì)胞中升高的IL-8水平,但NF-κB抑制劑BAY11-7082卻降低了IL-8的高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-8水平的增加可能參與類(lèi)固醇拮抗型中性粒細(xì)胞型氣道炎癥,而這種機(jī)制可能與通過(guò)激活NF-κB途徑有關(guān)。 脾酪氨酸激酶(Syk)可表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞內(nèi),在急性和慢性炎癥中,通過(guò)細(xì)胞外抗原誘導(dǎo)的IgE受體FcεRI介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。本研究的目的是觀察二苯乙烯類(lèi)化合物Vam3對(duì)免疫復(fù)合物誘導(dǎo)炎癥的抑制及其機(jī)制。首先,建立了以Km原理高通量化合物篩選模型,觀察Vam3對(duì)Syk激酶的抑制作用。其次,通過(guò)活化IgE受體FcεRI介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化,評(píng)價(jià)Vamm3在細(xì)胞水平上的抗炎作用。最后,應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)評(píng)價(jià)Vam3對(duì)Syk激酶下游信號(hào)通路的影響。結(jié)果觀察到二苯乙烯類(lèi)化合物Vam3競(jìng)爭(zhēng)性抑制了Syk激酶的催化活性,其Ki和IC50值分別為61.09nM和62.95nM。 Vam3在細(xì)胞水平上以劑量依賴(lài)的方式降低了大鼠腹腔肥大細(xì)胞和RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平。同時(shí),Vam3抑制了多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,如腫瘤壞死因子TNF-α, IL-6, IL-8等,其IC50值分別為3.2μM、2.43μM、1.3μM。此外,通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)Vam3能夠抑制Syk蛋白激酶的Y525/526位點(diǎn)、下游分子LAT的Y191位點(diǎn)、cPLA2的S505位點(diǎn)、PLCγ-1的Y783位點(diǎn)和S1248位點(diǎn)的磷酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了Vam3是通過(guò)抑制Syk的催化活性,導(dǎo)致下游分子LAT、cPLA2、PLCγ-1活化的抑制,進(jìn)而抑制炎癥細(xì)胞的活化和下游炎癥因子的釋放。本研究所建立的高通量篩選Syk激酶特異性抑制方法為以Syk為靶點(diǎn)的抗哮喘藥物篩選及其抗哮喘慢性氣道炎癥機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:At present, about 300 million people worldwide suffer from asthma, most of them have achieved good results in the treatment of acute asthma by inhaling immunosuppressive agents (such as glucocorticoid) and p- adrenergic receptor agonists. However, about 5% to 10% of chronic asthma patients have poor response to this kind of treatment. There is still a great gap in the prevention, diagnosis and treatment of this kind of disease. There are also various problems, such as long-term side effects or difficult absorption, and the study of the mechanism of steroid antagonistic airway inflammation and the development of effective drugs for such diseases. The aim of this study is to explore the mechanism of chronic airway inflammation and to evaluate the anti-inflammatory mechanism of the Syk kinase specific inhibitor, Vam3, which is a high throughput screening of Km (Michaelis constant) principle, in order to develop a new class of drugs for the treatment of chronic airway inflammation.
The sensitization of most asthmatic patients is a variety of antigen in the environment, but only one kind of allergen is used in most experimental animal models. It does not reflect the nature of the patient's pathogenesis. This study established a chronic asthma model by using 3 types of allergen complex (DRA) immune animals, which were composed of common dust mites, ragweed and Aspergillus. And we found that NF- kappa B affects the expression and activity of inflammatory factor IL-8 in chronic airway inflammation. First, female BALB/c mice are divided into 3 groups: dust mites in model group and drug group, ragweed and Aspergillus (DRA) as antigen, saline as control, repeated immune animals for 10 weeks. Secondly, dexamethasone in the drug group is treated as a treatment. The treatment, the control group and the model group were treated with saline as a placebo, two weeks after oral administration of the stomach, 1 times a day. The results showed that DRA increased the IL-10, TGF- beta level and neutrophils in the lung tissue of the bronchoalveolar perfusion (BAL) fluid in mice. The infiltration of large cells and hypersecretion of mucus. However, dexamethasone did not decrease and increased the level of neutrophils infiltration and human function homologous IL-8. In vitro studies have found that Der P1 of the main antigen of dust mite can stimulate human alveolar epithelial A549 cells and enhance the gene expression of IL-8 and the activity of NF- kappa B. Dexamethasone inhibited the elevated IL-8 level in A549 cells, but NF- kappa B inhibitor BAY11-7082 reduced the high expression of IL-8. The experimental results showed that the increase of IL-8 level may be involved in steroid antagonistic neutrophil type airway inflammation, which may be related to the activation of NF- kappa B pathway.
Splenic tyrosine kinase (Syk) can be expressed in a variety of immune cells, such as T cells, B cells, mast cells, and in acute and chronic inflammation, and plays an important role in the activation of immune cells mediated by the IgE receptor Fc e RI induced by extracellular antigen. The purpose of this study was to observe the inflammation induced by the two phenyl ethylene compound Vam3 on immune complexes. Inhibition and its mechanism. First, a high throughput screening model based on Km principle was established to observe the inhibitory effect of Vam3 on Syk kinase. Secondly, the anti-inflammatory effect of Vamm3 on cell level was evaluated by activating IgE receptor Fc e RI mediated immune cell activation. Finally, protein immunoblotting technique was used to evaluate the downstream signal pathway of Vam3 against Syk kinase. The results showed that the two styrene compound Vam3 competitively inhibited the catalytic activity of Syk kinase, and its Ki and IC50 values were 61.09nM and 62.95nM. Vam3, respectively, at a dose dependent manner at the cell level, reducing the level of Ca2+ in rat peritoneal mast cells and RBL-2H3 cells. Meanwhile, Vam3 inhibited the production of a variety of inflammatory mediators. Such as tumor necrosis factor TNF- alpha, IL-6, IL-8 and so on, their IC50 values are 3.2 mu M, 2.43 mu M, 1.3 mu M., and Vam3 can inhibit the Y525/526 loci of Syk protein kinase by protein immunoblotting. Inhibition of the activation of the downstream molecules, LAT, cPLA2, and PLC gamma -1 by inhibiting the catalytic activity of Syk, thus inhibits the activation of inflammatory cells and the release of downstream inflammatory factors. The high throughput screening of Syk kinase specific inhibition methods established by this study is the screening of anti asthma drugs with Syk as the target and the mechanism of chronic airway inflammation in asthma. The experimental basis is provided.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25

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