本文選題：支氣管哮喘 + 機(jī)械牽張��； 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景： 最常見的氣道炎癥性疾病是支氣管哮喘,其發(fā)生率在世界范圍內(nèi)逐年增加,嚴(yán)重危害公眾健康,增加了社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在發(fā)達(dá)國家,成人支氣管哮喘的發(fā)生率將近10%,在兒童中更高。在發(fā)展中國家,發(fā)生率稍低,但是增長迅速。 支氣管哮喘是一種氣道反應(yīng)性疾病,炎癥反應(yīng)在其病理機(jī)制中起到非常重要的作用。目前關(guān)于哮喘病理機(jī)制的研究集中在變應(yīng)原和刺激劑引發(fā)的炎性反應(yīng)過程。除了生物化學(xué)刺激,物理的力學(xué)作用在調(diào)節(jié)肺的結(jié)構(gòu)、功能和代謝方面亦發(fā)揮了重要的作用。支氣管哮喘的病人,肺組織和正常呼吸時相比遭受了更多的牽張,并且牽張加重了支氣管哮喘時的氣道阻力,機(jī)械牽張可以誘發(fā)哮喘中的炎癥反應(yīng),但是具體的機(jī)制仍不清楚。支氣管上皮細(xì)胞是產(chǎn)花粉植物最初的切觸點(diǎn),并且目前成為許多研究感興趣的靶點(diǎn)。支氣管上皮細(xì)胞不僅是物理屏障,而且在氣道炎癥反應(yīng)中有積極作用。支氣管上皮細(xì)胞能合成炎癥細(xì)胞因子,從而來影響局部組織免疫細(xì)胞的募集和活化,并且創(chuàng)造一個微環(huán)境使免疫細(xì)胞參與炎性反應(yīng)過程。 多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)富含在真核生物細(xì)胞核,占據(jù)多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)在細(xì)胞內(nèi)將近90%的活性,它可以調(diào)節(jié)許多炎癥細(xì)胞因子表達(dá)。在細(xì)胞核內(nèi),PARP-1能被DNA斷裂、氧化應(yīng)激、環(huán)境刺激等活化,并且參與許多反應(yīng),催化NAD+成煙酰胺和ADP核糖,在目標(biāo)蛋白上形成ADP核糖聚合物,包括轉(zhuǎn)錄因子和自身。然而,PARP-1過度活化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP耗竭,導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝危機(jī)和細(xì)胞死亡。PARP-1激活和許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),如心血管疾病、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、內(nèi)毒素休克和中風(fēng)等。此外,PARP-1已被證實(shí)調(diào)控許多重要的炎癥基因的表達(dá),像VCAM-1,其是被核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)調(diào)節(jié)。PARP-1已被證實(shí)和支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。PARP-1拮抗劑阻止了變應(yīng)原暴露后炎癥細(xì)胞在肺組織的浸潤。在變應(yīng)原誘導(dǎo)的支氣管哮喘模型,PARP-1缺失阻止了IL-5的表達(dá),通過calpain依賴的通路分解STAT-6蛋白。但是支氣管哮喘時機(jī)械牽張對PARP-1的影響仍不明確。 NF-κB是炎性反應(yīng)放大環(huán)路的重要轉(zhuǎn)錄因子,其活化和移位入細(xì)胞核能夠和許多基因啟動子的固定序列結(jié)合而啟動多種炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄,在炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到非常重要的作用。越來越多的證據(jù)表明NF-κB在支氣管哮喘炎癥介質(zhì)的分泌過程中起到非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)PARP-1的抑制劑3-AB能阻止H202引起的NF-κB活化和IL-8分泌。PARP-1可以通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)。 研究目的： 在本實(shí)驗(yàn)中,研究PARP-1在機(jī)械牽張誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制。 研究方法： 在實(shí)驗(yàn)中,人支氣管上皮細(xì)胞(HBEpiCs)通過機(jī)械牽張而被刺激,分別刺激細(xì)胞4、8、12、16、24小時,靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞作為對照組。PARP-1的表達(dá)被siRNA干擾。 通過實(shí)時定量RT-PCR、蛋白印跡、ELISA、小干擾RNA的轉(zhuǎn)染以及免疫熒光等方法,分別檢測牽張刺激組及陰性對照組中炎癥因子相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)量。氧化應(yīng)激通過對超氧化物敏感的熒光染料-DHE來檢測超氧化物的含量水平。DNA損傷通過彗星分析法(單細(xì)胞凝膠電泳)評估。 研究結(jié)果： 1.IL-8和血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)的表達(dá)受到機(jī)械牽張調(diào)節(jié),并呈時間依賴性。 給予牽張力刺激人支氣管上皮細(xì)胞不同的時間點(diǎn),0、4、8、12、16、24小時。牽張刺激呈時間依賴性調(diào)控IL-8和VCAM-1的表達(dá)。和靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞比較,牽張刺激24小時會明顯增加VCAM-1mRNA和蛋白表達(dá)量,ELISA法也表明IL-8分泌因牽張刺激而上調(diào)(P0.05)。 2.機(jī)械牽張可能通過上調(diào)PARP-1的表達(dá)和活性來誘導(dǎo)超氧化物產(chǎn)生和DNA損傷。 在人支氣管上皮細(xì)胞被牽張24小時后,我們檢測了牽張對PARP-1表達(dá)和活性的影響。和靜止?fàn)顟B(tài)細(xì)胞相比,牽張使PARP-1表達(dá)明顯增加,而且PARP-1活性亦明顯上調(diào)(P0.05)。 靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞幾乎沒有超氧化物產(chǎn)生。然而牽張刺激會導(dǎo)致明顯的氧化應(yīng)激(P0.05)。 在靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞,在尾部幾乎沒有DNA損傷,但是牽張刺激會明顯增加細(xì)胞尾部DNA百分含量,這表明牽張刺激會導(dǎo)致人支氣管上皮細(xì)胞DNA損傷。 3. PARP-1基因沉默減輕了機(jī)械牽張導(dǎo)致的IL-8和VCAM-1的表達(dá)上調(diào),并減輕了單核細(xì)胞的粘附,這和阻止了核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)的移位有關(guān)。 和靜止?fàn)顟B(tài)細(xì)胞相比,牽張刺激明顯增加了IL-8分泌和VCAM-1表達(dá)。然而,PARP-1基因沉默后,IL-8分泌和VCAM-1表達(dá)明顯減少(P0.05),PARP-1siRNA陰性對照對炎癥細(xì)胞因子表達(dá)沒有明顯影響。 和靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞相比,牽張刺激人支氣管上皮細(xì)胞導(dǎo)致單核細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)的粘附性明顯增加,然而在牽張刺激前用PARP-1siRNA預(yù)處理導(dǎo)致單核細(xì)胞的粘附性明顯下降。 NF-κB p65在牽張刺激前主要位于胞漿,但是在刺激后迅速發(fā)生位置變化,移位到細(xì)胞核內(nèi)。PARP-1基因沉默后,雖給予牽張刺激p65仍位于細(xì)胞漿。 研究結(jié)論： 1.機(jī)械牽張會誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、超氧化物產(chǎn)生和DNA損傷。 2. PARP-1基因沉默減輕了IL-8和VCAM-1的表達(dá),部分是因?yàn)樽柚沽薔F-κB的核移位。 3. PARP-1在機(jī)械牽張誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中起到重要作用。 4. PARP-1基因沉默在逆轉(zhuǎn)哮喘支氣管上皮炎癥反應(yīng)中可能會是一個潛在的治療途徑。
[Abstract]:Background of Study :

The most common inflammatory diseases of the airways are bronchial asthma , the incidence of which increases year by year in the world , poses a serious threat to the health of the public and increases the socio - economic burden . In developed countries , the incidence of adult bronchial asthma is almost 10 per cent and is higher among children . In developing countries , the incidence is slightly lower , but growth is rapid .

Bronchial epithelial cells are an important role in regulating the structure , function and metabolism of lung . In addition to biochemical stimulation , physical and mechanical effects play an important role in regulating the structure , function and metabolism of lung .

Poly ( ADP - ribose ) polymerase - 1 ( parp - 1 ) is rich in eukaryotic cell nuclei , which occupies nearly 90 % of the activity of poly ( ADP - ribose polymerase ) in cells . It can regulate the expression of NAD + and ATP in cells . It is involved in many reactions , such as cardiovascular disease , diabetes , rheumatoid arthritis , endotoxic shock , apoplexy , etc .

NF - 魏B is an important transcription factor of inflammatory response amplification loop . Its activation and translocation into the nucleus can initiate transcription of various inflammatory mediators and play a very important role in the development of inflammatory diseases .

Purpose of study :

In this experiment , the role and mechanism of parp - 1 in the inflammatory response of human bronchial epithelial cells induced by mechanical stretch was studied .

Study method :

In the experiment , human bronchial epithelial cells ( HBEPCs ) were stimulated by mechanical tension , and cells 4 , 8 , 12 , 16 , 24 hours were stimulated respectively , and the cells in quiescent state were used as control groups . The expression of parp - 1 was disrupted by siRNA .

By means of real - time quantitative RT - PCR , Western blot , ELISA , transfection of small interfering RNA and immunofluorescence , the expression of inflammatory factor related genes and proteins in the control group and negative control group were detected respectively . Oxidative stress was assessed by comet assay ( single cell gel electrophoresis ) .

Results of the study :

1 . The expression of IL - 8 and VCAM - 1 was mechanically regulated and time - dependent .

The expression of VCAM - 1 mRNA and VCAM - 1 was significantly increased in 24 hours , and the level of VCAM - 1 mRNA and protein expression was significantly increased in 24 hours . ELISA method also showed that IL - 8 secretion was up - regulated by the stimulation ( P0.05 ) .

2 . Mechanical drafting may induce superoxide generation and DNA damage by up - regulation of the expression and activity of parp - 1 .

After 24 hours in human bronchial epithelial cells , we examined the influence of the stretch on the expression and activity of parp - 1 . Compared with the resting state cells , the stretch increased the expression of parp - 1 , and the activity of parp - 1 was also increased significantly ( P0.05 ) .

Cells in the quiescent state were almost free of superoxide generation , however , the stimulus could lead to significant oxidative stress ( P0.05 ) .

In the quiescent state cells , there was little DNA damage at the tail , but the stretch increase significantly increased the percentage of DNA in the tail of the cell , suggesting that the stimulus would lead to DNA damage to the human bronchial epithelial cells .

3 . The expression of IL - 8 and VCAM - 1 induced by mechanical tension was reduced by the silencing of the gene silencing by the gene silencing , and the adhesion of monocytes was reduced , which was related to the inhibition of the translocation of nuclear transcription factor - kappa B ( NF - 魏B ) .

However , IL - 8 secretion and VCAM - 1 expression were significantly decreased ( P0.05 ) .

As compared with the cells in the quiescent state , the stretch - stimulating human bronchial epithelial cells resulted in a significant increase in adhesion of monocytes ( THP - 1 cells ) , however pre - treatment with poly - 1 siRNA prior to stretching resulted in a significant decrease in adhesion of monocytes .

NF - 魏B was mainly located in the cytoplasm before the stimulation , but after the stimulation , the position changed rapidly and shifted to the nucleus . After the silencing of the gene , it was still in the cytoplasm , although it was given the stretch - stimulated P65 .

Conclusions of the study :

1 . Mechanical drawing can induce inflammatory reaction , superoxide generation and DNA damage in human bronchial epithelial cells .

2 . The expression of IL - 8 and VCAM - 1 was reduced in part by silencing of the gene silencing of NF - 魏B in part because of the inhibition of nuclear translocation of NF - 魏B .

3 . parp - 1 plays an important role in the inflammatory response induced by mechanical tension .

4 . The silencing of parp - 1 gene may be a potential therapeutic approach in the reversal of bronchial epithelial inflammatory response in asthma .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1872442