本文選題：肺纖維化 + 小鼠肺成纖維細胞　； 參考：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：[背景]間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是由多種病因所致的彌漫性肺實質(zhì)、肺泡炎癥,以及間質(zhì)纖維化為病理特征的一類疾病。約35%~45%ILD與結(jié)締組織病(connective tissue diseases,CTD)相關(guān),而CTD相關(guān)性ILD(CTD-ILD)患病率可高達60%以上。肺纖維化是CTD-ILD的終末結(jié)局,一旦發(fā)生肺纖維化,嚴(yán)重影響CTD患者的生存和生活質(zhì)量。CTD相關(guān)肺纖維化的發(fā)病機制尚不明確,涉及免疫調(diào)節(jié)紊亂及炎癥,多種免疫細胞、細胞因子、肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞、炎癥介質(zhì)、細胞外基質(zhì)以及轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming-growth factor beta 1,TGF-β1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等參與其發(fā)病,但不能完全闡釋該病的發(fā)生發(fā)展。隨著氧化應(yīng)激與肺纖維化及CTD研究的不斷深入,氧化應(yīng)激在CTD相關(guān)的肺纖維化發(fā)病中的作用及發(fā)病機制值得進一步的研究。BTB-cap‘n’collar(CNC)同源異構(gòu)體1[BTB(broad-complex,tramtrack and bric-a-brac)and CNC(cap'n'collar protein)homology 1,Bach1]是CNC家族的一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,通過競爭性抑制核因子E相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid-related factor 2,Nrf2)參與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié),而Nrf2是機體抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者,通過刺激其下游的抗氧化因子的產(chǎn)生來增加組織細胞氧化應(yīng)激能力,抑制肺纖維化的進展,提示Bachl可能參與肺纖維化的發(fā)病。目前國內(nèi)外尚缺乏Bachl與CTD相關(guān)肺纖維化發(fā)病的關(guān)系及作用機制的研究。因此,本研究選擇Bachl為靶點,采用小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)技術(shù)沉默Bachl基因,體外研究采用TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細胞模擬纖維化的細胞模型,體內(nèi)研究則采用博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模擬CTD相關(guān)肺纖維化的動物模型,觀察Bachl si RNA對TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細胞及博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的氧化/抗氧化能力及纖維化進程的影響,初步探討B(tài)achl在CTD相關(guān)肺纖維化發(fā)病中的作用及Bachl si RNA對CTD相關(guān)肺纖維化的抗氧化效應(yīng)及治療作用。[目的]本研究基于氧化應(yīng)激參與肺纖維化的發(fā)病及Bachl對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用,研究Bachl在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠發(fā)病中的作用及機制,探討B(tài)achl與CTD相關(guān)肺纖維化的關(guān)系及其作為CTD肺纖維化治療靶點的可能性。[方法]1.Bach1 si RNA重組腺病毒的構(gòu)建構(gòu)建兩段Bach1 si RNA腺病毒載體及一段空病毒載體,酶切及基因測序鑒定是否與設(shè)計的序列一致,構(gòu)建后的重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠肺成纖維細胞,熒光顯微鏡及流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)及蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)檢測Bach1 m RNA和蛋白表達來觀察沉默效率。2.細胞實驗培養(yǎng)小鼠肺成纖維細胞,接種密度1×105/m L,細胞分五組:空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+空載體組,TGF-β1+Bach1#1 si RNA組及TGF-β1+Bach1#2si RNA組,細胞饑餓培養(yǎng)24h,更換含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培養(yǎng)基,空白對照組不予處理,TGF-β1組的細胞給予5ng/m L TGF-β1處理72h,TGF-β1+空載體組的細胞給予5ng/m L TGF-β1處理24h后給予感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為50的空病毒載體轉(zhuǎn)染48h,TGF-β1+Bach1#1si RNA組的細胞給予5ng/m L TGF-β1處理24h后給予50 MOI的Bach1#1 si RNA轉(zhuǎn)染48h,TGF-β1+Bach1#2 si RNA組細胞給予5ng/m L TGF-β1處理24h后給予50 MOI的Bach1#2 si RNA轉(zhuǎn)染48h。CCK8檢測細胞的增殖能力;RT-PCR及Western blot分別檢測細胞中Bach1、血紅素加氧酶1、谷胱甘肽過氧化酶1及NAD(P)H苯醌氧化還原酶1的m RNA和蛋白表達水平。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細胞上清液中白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及Ⅰ型膠原的水平,并分析小鼠肺成纖維細胞中Bach1的表達水平與細胞增殖能力、抗氧化因子和參與纖維化進程的因子表達水平之間的關(guān)系。3.動物實驗7-8周齡雄性近交系C57BL/6小鼠40只,隨機分為四組,對照組、博來霉素組、博來霉素+空載體組、博來霉素+Bach1 si RNA組,每組10只,后三組采用博來霉素(5.0 mg/kg)氣管內(nèi)注射,對照組小鼠氣管內(nèi)注射與模型組小鼠等體積的0.9%生理鹽水,博來霉素+空載體組、博來霉素+Bach1 si RNA組小鼠成功造模后分別尾靜脈注射空載體(1×109pfu)及體外實驗優(yōu)選的Bach1 si RNA腺病毒載體(1×109pfu),兩天1次,共注射2周。于干預(yù)終點處死小鼠,留取血清、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺組織,RT-PCR及Western Blot檢測小鼠肺組織中Bach1及抗氧化因子血紅素加氧酶1、谷胱甘肽過氧化酶1及NAD(P)H苯醌氧化還原酶1的m RNA及蛋白表達;ELISA檢測血清及BALF中IL-6及Ⅰ型膠原的水平;病理蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin,HE)及馬松(Masson)染色觀察肺組織炎癥及纖維化程度,并分析肺組織中Bach1的表達水平與抗氧化因子、參與纖維化進程的因子以及肺組織炎癥及纖維化評分之間的相關(guān)性。4.統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,多個組間的比較采用單因素方差分析;若方差齊,組內(nèi)兩兩之間的比較采用LSD檢驗,若方差不齊,組內(nèi)兩兩比較則采用Tamhane檢驗;相關(guān)性分析正態(tài)分布資料應(yīng)用Pearson相關(guān),非正態(tài)分布資料應(yīng)用Spearman秩相關(guān)。P≤0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P≤0.01認為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,而P0.05認為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]1.Bach1 si RNA腺病毒載體的成功構(gòu)建基因測序結(jié)果與本研究設(shè)計的Bach1 si RNA序列完全相同;熒光檢測及流式細胞術(shù)結(jié)果表明兩段Bach1 si RNA對小鼠肺成纖維細胞的轉(zhuǎn)染效率達到90%以上,RT-PCR的結(jié)果表明兩段Bach1 si RNA轉(zhuǎn)染小鼠肺成纖維細胞后沉默效率達到70%以上,Western blot結(jié)果也顯示兩段Bach1 si RNA轉(zhuǎn)染小鼠肺成纖維細胞后,Bach1蛋白表達明顯抑制,以Bach1#1 si RNA更為明顯。2.Bach1 si RNA對TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細胞的作用2.1 Bach1 si RNA對TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細胞增殖能力的影響CCK8結(jié)果表明:TGF-β1處理后48 h及72 h,小鼠肺成纖維細胞的增殖能力較空白對照組明顯升高(0.50±0.03與0.44±0.02及0.92±0.02與0.65±0.01,P均≤0.05),但兩段Bach1 si RNA干預(yù)后48 h,增殖能力較TGF-β1組相比則明顯下降(0.33±0.00與0.50±0.03以及0.35±0.05與0.50±0.03,P均≤0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.2 Bach1 si RNA對TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細胞中抗氧化因子表達的影響RT-PCR的結(jié)果表明,TGF-β1處理后,與空白對照組相比,小鼠肺成纖維細胞中Bach1 m RNA的表達明顯升高(2.13±0.09與1.00±0.07,P≤0.05),而血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1的m RNA表達則明顯降低(0.40±0.04與1.00±0.02及0.57±0.11與1.00±0.26,P≤0.05及P≤0.01);但Bach1 si RNA干預(yù)后,與TGF-β1組相比,Bach1 m RNA表達明顯下降(0.15±0.02與2.13±0.09,P≤0.01),而血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1的m RNA表達明顯升高(3.30±0.29與0.40±0.04及1.84±0.23與0.57±0.11,P≤0.05及P≤0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β1及Bach1 si RNA干預(yù)后,與對照組相比,NAD(P)H苯醌氧化還原酶1m RNA表達之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.78±0.15,0.75±0.06與1.00±0.29,P均0.05)。Western blot結(jié)果顯示TGF-β1促進小鼠肺成纖維細胞中Bach1蛋白的表達,但抑制血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1的蛋白表達;Bach1 si RNA干預(yù)后,與TGF-β1組及TGF-β1+空載體組相比,Bach1蛋白表達明顯抑制,但血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1蛋白表達則明顯升高;TGF-β1及Bach1si RNA干預(yù)后NAD(P)H苯醌氧化還原酶1蛋白的表達與空白對照組無明顯差異。2.3 Bach1 si RNA對TGF-β1誘導(dǎo)后的小鼠肺成纖維細胞中IL-6及Ⅰ型膠原表達的影響ELISA的結(jié)果表明:TGF-β1處理小鼠肺成纖維細胞后,與空白對照組相比,細胞上清中纖維化進程相關(guān)細胞因子IL-6及細胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原的表達明顯升高(33.62±5.72與20.29±4.88及32.77±4.04與23.40±2.36,P均≤0.01);但Bach1si RNA轉(zhuǎn)染細胞,與TGF-β1組相比,細胞上清中IL-6及Ⅰ型膠原表達則明顯下降(11.11±3.17與33.62±5.72,P≤0.01及25.52±2.16與32.77±4.04,P≤0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.4 MLF中Bach1的表達與細胞增殖水平、抗氧化因子及纖維化進程相關(guān)因子表達之間的關(guān)系相關(guān)性分析結(jié)果表明小鼠肺成纖維細胞中Bach1的表達水平與細胞增殖水平呈正相關(guān)(r=0.40,P≤0.01),與纖維化進程相關(guān)因子IL-6及Ⅰ型膠原的表達水平也呈正相關(guān)(r=0.79及r=0.57,P均≤0.01),但與小鼠肺成纖維細胞中抗氧化因子血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1的表達水平呈負相關(guān)(r=-0.79及r=-0.64,P均≤0.01),差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;但Bach1的表達水平與NAD(P)H苯醌氧化還原酶1的表達水平之間無明顯相關(guān)性,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.13,P0.05)。3 Bach1 si RNA對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的作用3.1 Bach1 si RNA對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中抗氧化因子表達的影響RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示:與對照組小鼠相比,博來霉素組小鼠肺組織中Bach1 m RNA表達(2.34±0.15與1.00±0.13,P≤0.05)及蛋白表達明顯升高,而血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1 m RNA的表達(0.54±0.06與1.00±0.37,P≤0.05及0.30±0.02與1.00±0.15,P≤0.01)及蛋白的表達明顯減低;Bach1-si RNA處理后,與博來霉素組相比,肺組織中Bach1 m RNA(0.32±0.06與2.34±0.15,P≤0.01)及蛋白表達明顯下降,血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1m RNA(1.94±0.19與0.54±0.06及2.07±0.09與0.30±0.02,P均≤0.05)及蛋白表達則明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與對照組相比,博來霉素及Bach1 si RNA處理后小鼠肺組織中NAD(P)H苯醌氧化還原酶1 m RNA(0.80±0.07與1.00±0.26及0.79±0.07與1.00±0.26,P均0.05)及蛋白表達之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.2 Bach1 si RNA對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠血清及BALF中IL-6及Ⅰ型膠原表達的影響ELISA結(jié)果表明:與對照組相比,博來霉素組小鼠血清及BALF中IL-6(43.99±5.10與8.71±2.42及11.69±2.08與2.15±0.51,P均≤0.01)及Ⅰ型膠原(82.22±6.46與70.39±1.56,P≤0.05及5.50±0.54與2.53±0.12,P≤0.01)蛋白表達明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;與博來霉素組相比,Bach1-si RNA組血清及BALF中IL-6(12.88±2.93與43.99±5.10及1.83±0.37與11.69±2.08,P均≤0.01)以及Ⅰ型膠原(72.55±2.73與82.22±6.46,P≤0.05及3.85±0.78與5.50±0.54,P≤0.01)的蛋白表達則明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.3 Bach1-si RNA對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠病理形態(tài)改變的影響博來霉素造模后14天,肺CT及病理改變符合肺纖維化的影像和病理改變,模型成功后給予Bach1-si RNA干預(yù),于14天后與博來霉素組相比,HE染色可見小鼠肺泡間質(zhì)炎細胞浸潤及肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度較博來霉素組有所減輕;Masson染色可見間質(zhì)藍染的膠原纖維明顯減少,肺泡炎癥及纖維化程度明顯減輕(1.90±0.12與3.30±0.25及2.80±0.37與4.60±0.51,P均≤0.01),差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。3.4小鼠肺組織中Bach1的表達與抗氧化因子、參與纖維化進程的因子及病理改變的相關(guān)性分析的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果表明:小鼠肺組織中Bach1的表達水平與抗氧化因子血紅素加氧酶1及谷胱甘肽過氧化酶1的表達水平呈負相關(guān)(r=-0.69及r=-0.56,P均≤0.01);Bach1的表達水平與血清和BALF中IL-6(r=0.62及r=0.65,P均≤0.01)和Ⅰ型膠原的表達水平(r=0.61及r=0.54,P均≤0.01)以及肺泡炎和纖維化評分呈正相關(guān)(r=0.35及r=0.33,P均≤0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義;Bach1的表達水平與NAD(P)H苯醌氧化還原酶1的表達水平之間無明顯相關(guān)性,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.06,P0.05)。[結(jié)論]1、TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細胞中及博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中Bach1表達明顯升高。2、沉默Bach1抑制小鼠肺成纖維細胞的增殖、抑制小鼠肺成纖維細胞和肺組織中纖維化進程相關(guān)因子的表達,促進抗氧化因子的表達。3、Bach1的表達與抗氧化因子水平呈負相關(guān),與小鼠成纖維細胞增殖能力、纖維化進程相關(guān)因子、肺泡炎和纖維化的程度呈正相關(guān)。4、Bach1通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激,參與肺纖維化的發(fā)病和進展,為深入研究CTD相關(guān)肺纖維化的作用機制及篩選治療靶點提供實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳曉玲,黃善生,凌亦凌,李文斌,王新良;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性變化對肺纖維化形成的影響[J];中國病理生理雜志;2000年10期

2 康衛(wèi)國,劉久山;肺纖維化的診斷[J];臨床薈萃;2001年14期

3 李學(xué)軍;肺纖維化治療研究進展[J];中國綜合臨床;2001年10期

4 王興勝;肺纖維化治療的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);2001年09期

5 劉慶華;轉(zhuǎn)化生長因子-β與肺纖維化[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);2002年08期

6 孟瑩,李旭,蔡紹曦;局部組織腎素—血管緊張素系統(tǒng)在肺纖維化中的作用[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2002年12期

7 周賢梅,戴令娟,蔡后榮,侯杰;慢性阻塞性肺疾病合并肺纖維化臨床分析[J];臨床薈萃;2003年22期

8 耿開興;肺纖維化60例臨床分析[J];中原醫(yī)刊;2003年12期

9 何平平;張平;;局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與肺纖維化[J];醫(yī)學(xué)綜述;2007年09期

10 張永勝;馮一中;顧振綸;;藥物防治肺纖維化的研究進展[J];中國血液流變學(xué)雜志;2007年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 賈英杰;李小江;孫一予;陳軍;張瑩;黃敏娜;包芳芳;;肺癌放化療導(dǎo)致肺纖維化中醫(yī)藥干預(yù)的研究現(xiàn)狀[A];2009年首屆全國中西醫(yī)腫瘤博士及中青年醫(yī)師論壇論文集[C];2009年

2 張紓難;孫瑞華;;建立肺纖維化生存質(zhì)量評價體系方法初探[A];第五次全國中西醫(yī)結(jié)合呼吸病學(xué)術(shù)交流大會論文匯編[C];2000年

3 黃山英;宋良文;張勇;孫麗;尹紀(jì)業(yè);;Ⅳ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶在大鼠早期肺纖維化啟動中的作用機制[A];第六屆全國生物醫(yī)學(xué)體視學(xué)學(xué)術(shù)會議暨第九屆全軍軍事病理學(xué)學(xué)術(shù)會議、第五屆全軍定量病理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

4 畢黎琦;孫文鑄;郭嘉隆;杜娟;周鳳嬌;;胰島素樣生長因子-Ⅰ和轉(zhuǎn)化生長因子-β1在肺纖維化形成中的作用研究[A];第十二屆全國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

5 王星;李世彬;王詠梅;吳琦;;酒精與大鼠肺纖維化關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

6 楊乃女;嚴(yán)賴莎;陳少賢;;氟伐他汀對大鼠肺纖維化干預(yù)作用的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2011（第十二次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議）論文匯編[C];2011年

7 劉建秋;黃利華;李竹英;;化纖湯防治肺纖維化的實驗研究[A];第七次全國中西醫(yī)結(jié)合呼吸病學(xué)術(shù)交流大會論文匯編（一）[C];2004年

8 楊s，

本文編號：1780146