本文選題：FOXO3a　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)化生長因子β　出處：《廣東藥科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：1研究背景間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是一系列可累及肺間質(zhì)、氣道以及肺泡的肺部彌漫性病變,通常在細(xì)支氣管末端有各類胞外基質(zhì)沉積及細(xì)胞浸潤,表現(xiàn)為肺泡-毛細(xì)血管功能單元逐漸損傷,其最后的發(fā)展結(jié)果為彌漫性肺纖維化以及蜂窩肺。ILD目前治療效果差,病死率高,其中尤其是特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),其病理生理過程及確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前仍欠缺特異有效的治療手段以阻止或逆轉(zhuǎn)其病程的進(jìn)展。目前的研究公認(rèn)IPF的發(fā)病機(jī)制為肺泡及支氣管上皮細(xì)胞的損傷[1-3]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)在ILD發(fā)病機(jī)制中的作用得到廣泛關(guān)注,被認(rèn)為是肺纖維化的重要特征,其關(guān)鍵的病理生理改變?yōu)樯掀p傷后在修復(fù)過程中所出現(xiàn)的失調(diào)現(xiàn)象。氣道上皮細(xì)胞在各種纖維化因素的誘導(dǎo)下,向間充質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞等)轉(zhuǎn)分化,上皮細(xì)胞之間的連接、粘附結(jié)構(gòu)及極性消失,取而代之的是Ⅰ型膠原和纖維結(jié)合素合成增多,同時(shí)伴有細(xì)胞器異常分布、細(xì)胞框架重組等改變。以上各因素成為肺間質(zhì)纖維化在細(xì)胞學(xué)層面上發(fā)生變化的基礎(chǔ)。目前對于肺纖維化EMT的機(jī)制尚未完全了解,有相關(guān)的研究證實(shí)其與EGFR/Akt、TGF-β/Smad等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[4-5]。明確其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),在纖維化早期抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化,能夠有效遏制ILD的進(jìn)展。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及其他功能的重要分子,同時(shí)也是是肺纖維化中啟動(dòng)EMT的一個(gè)重要因子。有相關(guān)研究表明,在組織細(xì)胞中TGF-β可通過Smad通路誘導(dǎo)EMT,導(dǎo)致組織器官纖維化的產(chǎn)生[6-7]。在國內(nèi)外的各項(xiàng)研究中,無論體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與離體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了增強(qiáng)TGF-β的表達(dá)可產(chǎn)生EMT過程,出現(xiàn)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活性,導(dǎo)致肺纖維化的產(chǎn)生。叉頭框蛋白(forkhead box protein,FOX)家族是一類參與機(jī)體生長發(fā)育、新陳代謝等多方面的轉(zhuǎn)錄因子,與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等功能相關(guān)。近年研究表明,FOX家族在細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中起到重要的調(diào)控作用[8],叉頭框蛋白O3a(forkheadbox protein O3a,Foxo3a)作為家族中一員,可以影響纖維化的進(jìn)展。研究表明FOXO3a在TGF-β誘導(dǎo)的腎上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中起重要作用[9]。另有研究表明FOXO3a參與了肺纖維化EMT過程,可能與纖維化時(shí)FOXO3a對轉(zhuǎn)分化基因Snail抑制減少有關(guān)[8]。本課題組前期對肺纖維化的研究表明,應(yīng)用EGFR-TKI代表藥物吉非替尼下調(diào)TGF-β通路,可出現(xiàn)FOXO3a表達(dá)增加,同時(shí)明顯減輕博來霉素所致的肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化。本研究推測FOXO3a是EMT過程中的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),參與了TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化EMT過程,在肺組織纖維化EMT過程中,通過TGF-β/Smad通路起到關(guān)鍵作用。因此,為進(jìn)一步研究TGF-β誘導(dǎo)下EMT中的FOXO3a活性變化、FOXO3a對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,本研究需探討FOXO3a在肺纖維化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中的作用,以為后續(xù)的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2研究目的2.1采用TGF-β刺激人支氣管上皮細(xì)胞,評估其上皮細(xì)胞表型及間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)變化,建立ILD體外細(xì)胞EMT模型。2.2.探討FOXO3a在細(xì)胞EMT過程中表達(dá)水平變化。2.3通過基因重組技術(shù),探討驗(yàn)證了增強(qiáng)FOXO3a的表達(dá)在肺間質(zhì)纖維化EMT中起到的作用,為完善肺纖維化過程中EMT機(jī)制、探求抑制肺纖維化治療新靶點(diǎn)提供新的思路。3方法和材料支氣管上皮細(xì)胞來源的16HBE細(xì)胞由廣州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科細(xì)胞庫提供。16HBE細(xì)胞在含10%滅活小牛血清的RPMI-1640高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基中,置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.1支氣管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型的構(gòu)建3.1.1 TGF-β誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞α-SMA及E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)變化16HBE細(xì)胞用含10%FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞接種于6孔板,10%FBS培養(yǎng)24h后,換1%FBS培養(yǎng)24h,實(shí)驗(yàn)分2組處理:(1)對照組;(2)10μg/L TGF-β組.細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后提取總RNA及總蛋白,PCR及Western Blot檢測E-cadherin和α-SMA的表達(dá)。3.1.2免疫組化法檢測E-cadherin和α-SMA在16HBE細(xì)胞上的定位及表達(dá)實(shí)驗(yàn)方法:16HBE細(xì)胞用含10%FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞接種于6孔板爬片,用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,換用含1%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,分2組處理:(1)對照組;(2)10μg/L TGF-β組.細(xì)胞分別培養(yǎng)48h后應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測E-cadherin和α-SMA的定位及表達(dá)。3.2 PCR、Western Blot檢測16HBE細(xì)胞EMT過程中FOXO3a mRNA和蛋白的表達(dá)16HBE細(xì)胞用含10%FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞接種于6孔板,用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,換用含1%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,分2組處理:(1)對照組;(2)10μg/L TGF-β組.細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后提取總RNA及總蛋白,PCR檢測FOXO3a的表達(dá)。3.3增強(qiáng)FOXO3a表達(dá)對細(xì)胞EMT的影響。3.3.1 FOXO3a質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證。從Gen Bank上獲取人FOXO3a基因的序列,設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增制備FOXO3a基因片段,按照試劑盒說明書電泳、凝膠,純化基因片段。利用限制性內(nèi)切酶消化獲得線性化載體,與FOXO3a基因重組并進(jìn)行轉(zhuǎn)化,取單菌落通過PCR技術(shù)鑒定,鑒定合格者進(jìn)行測序。將驗(yàn)證合格的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取。3.3.2檢測增強(qiáng)FOXO3a表達(dá)后,EMT過程中α-SMA、E-cadherin mRN A和蛋白的表達(dá)變化。分組為正常對照組,FOXO3a組,陰性質(zhì)粒組,TGF-β誘導(dǎo)組,TGF-β+FOXO3a組,TGF-β+陰性質(zhì)粒組。按試劑盒說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48h后獲取各組總RNA及總蛋白,PCR、Westernblot檢測各組α-SMA、E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)情況。3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用spss20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計(jì)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SX±)表現(xiàn)。各組數(shù)值均需先用方差齊性檢驗(yàn),組間均數(shù)的對比應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齊時(shí),多重對照應(yīng)用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí),多重對照接納Dunnett′s T3檢驗(yàn),取P0.05差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4結(jié)果4.1支氣管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型的構(gòu)建4.1.1 TGF-β誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞α-SMA及E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)變化10μg/L TGF-β組α-SM A mRNA隨時(shí)間表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);陰性對照組的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);10μg/L TGF-β組Ecadherin mRNA隨時(shí)間增加表達(dá)減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10μg/L TGF-β組α-SMA蛋白隨時(shí)間表達(dá)表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);10μg/L TGF-β組Ecadherin蛋白隨時(shí)間增加表達(dá)減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.1.2免疫組化法檢測E-cadherin和α-SMA在16HBE細(xì)胞上的定位及表達(dá)免疫組化結(jié)果提示,E-cadherin和α-SMA均分布于細(xì)胞質(zhì)中,E-cadherin在正常對照組中高表達(dá),TGF-β(10μg/L)誘導(dǎo)組中,E-cadherin表達(dá)明顯減弱。正常對照組中低表達(dá)的α-SMA,而TGF-β誘導(dǎo)組中,α-SMA的表達(dá)增多。4.2 PCR、Western Blot檢測16HBE細(xì)胞EMT過程中FOXO3a mRNA和蛋白的表達(dá)10μg/L TGF-β組FOXO3a mRN A隨時(shí)間增加表達(dá)減弱,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)10μg/L TGF-β組FOXO3a蛋白隨時(shí)間增加表達(dá)減弱,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)4.3增強(qiáng)FOXO3a表達(dá)對細(xì)胞EMT的影響。4.3.1 FOXO3a載體的構(gòu)建與驗(yàn)證。4.3.1.1 FOXO3a CDS全長序列PCR擴(kuò)增及鑒定經(jīng)吉?jiǎng)P基因測序驗(yàn)證,獲取的目的基因片段與Pubmed中人FOXO3a CDS基因序列相同。4.3.1.2單菌落PCR驗(yàn)證取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR電泳,電泳結(jié)果無誤。4.3.1.3質(zhì)粒測序結(jié)果取上述鑒定合格的GV230-FOXO3a質(zhì)粒送吉?jiǎng)P基因測序,與NCBI進(jìn)行對照,結(jié)果正確。4.3.1.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染熒光驗(yàn)證將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入16HBE細(xì)胞12h后,正常對照組未見綠色熒光,GV230-FOXO3a質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組可觀測到綠色熒光,證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功,并在細(xì)胞中表達(dá)蛋白。4.3.2檢測增強(qiáng)FOXO3a表達(dá)后,EMT過程中α-SMA、E-cadherin mRN A和蛋白的表達(dá)變化。TGF-β+FOXO3a質(zhì)粒組α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于TGF-β+陰性質(zhì)粒組及TGF-β誘導(dǎo)組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);TGF-β組與TGF-β+陰性質(zhì)粒組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);正常對照組,FOXO3a組,陰性質(zhì)粒組,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TGF-β+FOXO3a質(zhì)粒組E-cadherin mRN A和蛋白表達(dá)水平明顯高于TGF-β+陰性質(zhì)粒組及TGF-β誘導(dǎo)組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);TGF-β組與TGF-β+陰性質(zhì)粒組差別不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);正常對照組,FOXO3a組,陰性質(zhì)粒組,差別不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5結(jié)論TGF-β誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞可以成功在體外模擬EMT的過程,FOXO3a在TGF-β誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到抑制的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 蔡后榮;;2011年特發(fā)性肺纖維化診斷和治療循證新指南解讀[J];中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2011年04期

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本文編號：1686799