本文選題：FOXO3a　切入點：轉化生長因子β　出處：《廣東藥科大學》2017年碩士論文

【摘要】：1研究背景間質性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是一系列可累及肺間質、氣道以及肺泡的肺部彌漫性病變,通常在細支氣管末端有各類胞外基質沉積及細胞浸潤,表現為肺泡-毛細血管功能單元逐漸損傷,其最后的發(fā)展結果為彌漫性肺纖維化以及蜂窩肺。ILD目前治療效果差,病死率高,其中尤其是特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),其病理生理過程及確切的發(fā)病機制尚未完全闡明,目前仍欠缺特異有效的治療手段以阻止或逆轉其病程的進展。目前的研究公認IPF的發(fā)病機制為肺泡及支氣管上皮細胞的損傷[1-3]。上皮-間質轉分化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)在ILD發(fā)病機制中的作用得到廣泛關注,被認為是肺纖維化的重要特征,其關鍵的病理生理改變?yōu)樯掀p傷后在修復過程中所出現的失調現象。氣道上皮細胞在各種纖維化因素的誘導下,向間充質細胞(成纖維細胞、肌纖維母細胞等)轉分化,上皮細胞之間的連接、粘附結構及極性消失,取而代之的是Ⅰ型膠原和纖維結合素合成增多,同時伴有細胞器異常分布、細胞框架重組等改變。以上各因素成為肺間質纖維化在細胞學層面上發(fā)生變化的基礎。目前對于肺纖維化EMT的機制尚未完全了解,有相關的研究證實其與EGFR/Akt、TGF-β/Smad等信號轉導通路有關[4-5]。明確其中的關鍵環(huán)節(jié),在纖維化早期抑制上皮細胞間質轉分化,能夠有效遏制ILD的進展。轉化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是調控細胞增殖、分化及其他功能的重要分子,同時也是是肺纖維化中啟動EMT的一個重要因子。有相關研究表明,在組織細胞中TGF-β可通過Smad通路誘導EMT,導致組織器官纖維化的產生[6-7]。在國內外的各項研究中,無論體內實驗與離體實驗均證實了增強TGF-β的表達可產生EMT過程,出現成纖維細胞的生物學活性,導致肺纖維化的產生。叉頭框蛋白(forkhead box protein,FOX)家族是一類參與機體生長發(fā)育、新陳代謝等多方面的轉錄因子,與細胞增殖、凋亡、代謝等功能相關。近年研究表明,FOX家族在細胞上皮-間質轉分化過程中起到重要的調控作用[8],叉頭框蛋白O3a(forkheadbox protein O3a,Foxo3a)作為家族中一員,可以影響纖維化的進展。研究表明FOXO3a在TGF-β誘導的腎上皮間質轉分化中起重要作用[9]。另有研究表明FOXO3a參與了肺纖維化EMT過程,可能與纖維化時FOXO3a對轉分化基因Snail抑制減少有關[8]。本課題組前期對肺纖維化的研究表明,應用EGFR-TKI代表藥物吉非替尼下調TGF-β通路,可出現FOXO3a表達增加,同時明顯減輕博來霉素所致的肺間質纖維化細胞增殖及轉分化。本研究推測FOXO3a是EMT過程中的一個關鍵節(jié)點,參與了TGF-β誘導的肺纖維化EMT過程,在肺組織纖維化EMT過程中,通過TGF-β/Smad通路起到關鍵作用。因此,為進一步研究TGF-β誘導下EMT中的FOXO3a活性變化、FOXO3a對上皮-間質轉分化相關基因的轉錄調控機制,本研究需探討FOXO3a在肺纖維化上皮-間質轉分化過程中的作用,以為后續(xù)的研究奠定實驗基礎。2研究目的2.1采用TGF-β刺激人支氣管上皮細胞,評估其上皮細胞表型及間質細胞表型標志物表達變化,建立ILD體外細胞EMT模型。2.2.探討FOXO3a在細胞EMT過程中表達水平變化。2.3通過基因重組技術,探討驗證了增強FOXO3a的表達在肺間質纖維化EMT中起到的作用,為完善肺纖維化過程中EMT機制、探求抑制肺纖維化治療新靶點提供新的思路。3方法和材料支氣管上皮細胞來源的16HBE細胞由廣州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗科細胞庫提供。16HBE細胞在含10%滅活小牛血清的RPMI-1640高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基中,置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.1支氣管上皮細胞上皮-間質轉化模型的構建3.1.1 TGF-β誘導支氣管上皮細胞α-SMA及E-cadherin mRNA和蛋白的表達變化16HBE細胞用含10%FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細胞接種于6孔板,10%FBS培養(yǎng)24h后,換1%FBS培養(yǎng)24h,實驗分2組處理:(1)對照組;(2)10μg/L TGF-β組.細胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后提取總RNA及總蛋白,PCR及Western Blot檢測E-cadherin和α-SMA的表達。3.1.2免疫組化法檢測E-cadherin和α-SMA在16HBE細胞上的定位及表達實驗方法:16HBE細胞用含10%FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細胞接種于6孔板爬片,用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,換用含1%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,分2組處理:(1)對照組;(2)10μg/L TGF-β組.細胞分別培養(yǎng)48h后應用免疫組化技術檢測E-cadherin和α-SMA的定位及表達。3.2 PCR、Western Blot檢測16HBE細胞EMT過程中FOXO3a mRNA和蛋白的表達16HBE細胞用含10%FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細胞接種于6孔板,用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,換用含1%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,分2組處理:(1)對照組;(2)10μg/L TGF-β組.細胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后提取總RNA及總蛋白,PCR檢測FOXO3a的表達。3.3增強FOXO3a表達對細胞EMT的影響。3.3.1 FOXO3a質粒的構建及驗證。從Gen Bank上獲取人FOXO3a基因的序列,設計引物,PCR擴增制備FOXO3a基因片段,按照試劑盒說明書電泳、凝膠,純化基因片段。利用限制性內切酶消化獲得線性化載體,與FOXO3a基因重組并進行轉化,取單菌落通過PCR技術鑒定,鑒定合格者進行測序。將驗證合格的菌液進行擴大培養(yǎng),按照質粒小提試劑盒說明書進行質粒提取。3.3.2檢測增強FOXO3a表達后,EMT過程中α-SMA、E-cadherin mRN A和蛋白的表達變化。分組為正常對照組,FOXO3a組,陰性質粒組,TGF-β誘導組,TGF-β+FOXO3a組,TGF-β+陰性質粒組。按試劑盒說明書操作進行轉染,48h后獲取各組總RNA及總蛋白,PCR、Westernblot檢測各組α-SMA、E-cadherin mRNA和蛋白表達情況。3.4統(tǒng)計學方法應用spss20.0軟件進行數據分析,統(tǒng)計資料以均數±標準差(SX±)表現。各組數值均需先用方差齊性檢驗,組間均數的對比應用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齊時,多重對照應用LSD檢驗,方差不齊時,多重對照接納Dunnett′s T3檢驗,取P0.05差別有統(tǒng)計學意義。4結果4.1支氣管上皮細胞上皮-間質轉化模型的構建4.1.1 TGF-β誘導支氣管上皮細胞α-SMA及E-cadherin mRNA和蛋白的表達變化10μg/L TGF-β組α-SM A mRNA隨時間表達增強,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);陰性對照組的差別無統(tǒng)計學意義(P0.05);10μg/L TGF-β組Ecadherin mRNA隨時間增加表達減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。10μg/L TGF-β組α-SMA蛋白隨時間表達表達增強,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計學意義(P0.05);10μg/L TGF-β組Ecadherin蛋白隨時間增加表達減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.1.2免疫組化法檢測E-cadherin和α-SMA在16HBE細胞上的定位及表達免疫組化結果提示,E-cadherin和α-SMA均分布于細胞質中,E-cadherin在正常對照組中高表達,TGF-β(10μg/L)誘導組中,E-cadherin表達明顯減弱。正常對照組中低表達的α-SMA,而TGF-β誘導組中,α-SMA的表達增多。4.2 PCR、Western Blot檢測16HBE細胞EMT過程中FOXO3a mRNA和蛋白的表達10μg/L TGF-β組FOXO3a mRN A隨時間增加表達減弱,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)10μg/L TGF-β組FOXO3a蛋白隨時間增加表達減弱,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05);陰性對照組差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)4.3增強FOXO3a表達對細胞EMT的影響。4.3.1 FOXO3a載體的構建與驗證。4.3.1.1 FOXO3a CDS全長序列PCR擴增及鑒定經吉凱基因測序驗證,獲取的目的基因片段與Pubmed中人FOXO3a CDS基因序列相同。4.3.1.2單菌落PCR驗證取單個菌落進行PCR電泳,電泳結果無誤。4.3.1.3質粒測序結果取上述鑒定合格的GV230-FOXO3a質粒送吉凱基因測序,與NCBI進行對照,結果正確。4.3.1.4質粒轉染熒光驗證將重組質粒轉染入16HBE細胞12h后,正常對照組未見綠色熒光,GV230-FOXO3a質粒組及轉染陰性質粒組可觀測到綠色熒光,證明質粒轉染成功,并在細胞中表達蛋白。4.3.2檢測增強FOXO3a表達后,EMT過程中α-SMA、E-cadherin mRN A和蛋白的表達變化。TGF-β+FOXO3a質粒組α-SMA mRNA和蛋白表達水平明顯低于TGF-β+陰性質粒組及TGF-β誘導組,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);TGF-β組與TGF-β+陰性質粒組差別無統(tǒng)計學意義(P0.05);正常對照組,FOXO3a組,陰性質粒組,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。TGF-β+FOXO3a質粒組E-cadherin mRN A和蛋白表達水平明顯高于TGF-β+陰性質粒組及TGF-β誘導組,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);TGF-β組與TGF-β+陰性質粒組差別不具統(tǒng)計學意義(P0.05);正常對照組,FOXO3a組,陰性質粒組,差別不具統(tǒng)計學意義(P0.05)。5結論TGF-β誘導支氣管上皮細胞可以成功在體外模擬EMT的過程,FOXO3a在TGF-β誘導的支氣管上皮細胞上皮-間質轉化中起到抑制的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R563

【參考文獻】

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1 蔡后榮;;2011年特發(fā)性肺纖維化診斷和治療循證新指南解讀[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2011年04期

2 姚嬋;來茂德;;上皮間質轉化(EMT)及其分子機制[J];國際遺傳學雜志;2006年04期

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本文編號：1686799