本文選題：肺氣腫　切入點(diǎn)：動物模型　出處：《中南大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：第一章5-雜氮-2'-脫氧胞苷對香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型和干細(xì)胞抗原-1表達(dá)的影響 目的：探討經(jīng)腹腔注射香煙提取物(Cigarette Smoking Extract,CSE)所致肺氣腫小鼠模型的建立,腹腔注射5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, AZA)對肺氣腫動物模型的保護(hù)作用和對干細(xì)胞抗原-1(Stem Cell Antigen-1, Sca-1)表達(dá)的影響。 方法：32只4-6周齡的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對照組(N組)、AZA (A組)、CSE+AZA (AC組)及CSE(C組),每組8只,定時定量腹腔注射CSE溶液/AZA溶液/PBS溶液,第28天處理四組小鼠,檢測體重變化、Buxco系統(tǒng)及PLY3211小動物肺功能檢測系統(tǒng)行肺功能檢查、收集標(biāo)本。肺組織病理切片蘇木素-伊紅(HE)染色后觀察形態(tài)學(xué)改變并定量測定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI),肺組織TUNEL染色檢測肺泡間隔細(xì)胞凋亡。 將動物模型于造模第28天處死,密度梯度離心法分離小鼠骨髓EPCs并培養(yǎng)7天,Western Blotting檢測各組EPCs及肺組織Sca-1蛋白表達(dá),實時定量RT-PCR檢測各組EPCs及肺組織Sca-1mRNA表達(dá)。 結(jié)果：(1)(i)4組小鼠體重變化均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(ii)肺功能比較中,與正常對照組比較,AC組及C組小鼠氣道阻力(Raw)顯著增高(P0.01),動態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)、呼氣峰流速(PEF)及吸呼比(Ti/Te)降低(P0.05或P0.01),AC組和C組之間肺功能各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(iii)小鼠肺組織HE染色,形態(tài)學(xué)變化明顯,C組肺組織可見肺實質(zhì)破壞,肺泡間隔斷裂,肺泡壁變薄,肺泡腔融合、高度擴(kuò)大,肺氣腫明顯。各組MAST比較：與N組比較,A組、AC組和C組MAST均顯著降低(P0.01)；與A組比較,AC組和C組MAST顯著降低(P0.01)；與AC組比較,C組MAST降低(P0.05)。各組MLI比較：與N組比較,A組、AC組和C組MAST增高(P0.05或P0.01)；與A組比較,AC組和C組MAST顯著增高(P0.01)；與AC組比較,C組MAST增高(P0.05)。各組DI比較：與N組比較,A組、AC組和C組MAST均顯著增高(P0.01)；與A組比較,AC組和C組MAST顯著增高(P0.01)；與AC組比較,C組MAST增高(P0.05)。(iv)肺組織TUNEL染色,與N組比較,AC組和C組AI顯著增高(P0.01)；與A組比較,AC組和C組AI顯著增高(P0.01)；與AC組比較,C組AI顯著增高(P0.01)。 (2)(i)各組EPCs的Sca-1蛋白表達(dá)比較：與N組比較,AC組和C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.01)；與A組比較,AC組Sca-1蛋白表達(dá)量降低(P0.05),C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.01)；與AC組比較,C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.01)。(ii)各組EPCs的Sca-1mRNA表達(dá)比較：與N組比較,AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.01)。與A組比較,AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.01)。與AC組比較,C組之間Sca-1mRNA表達(dá)量降低(P0.05)。(iii)各組肺組織的Sca-1蛋白表達(dá)比較：與N組比較,A組、AC組和C組Sca-1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P0.01)；與A組比較,AC組和C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.01)；與AC組比較,C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.01)。(iv)各組肺組織的Sca-1mRNA表達(dá)比較：與N組比較,A組、AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.01)。與A組比較,AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.01)。與AC組比較,C組Sca-1mRNA表達(dá)量降低(P0.05)。 結(jié)論：(1)腹腔內(nèi)注射CSE可成功建立小鼠肺氣腫模型,縮短建模周期,且肺部形態(tài)學(xué)改變早于功能改變。(2)去甲基化劑可能通過部分逆轉(zhuǎn)CSE對骨髓EPCs及肺組織Sca-1表達(dá)的抑制作用,而發(fā)揮對肺氣腫動物模型肺功能和肺組織形態(tài)學(xué)的保護(hù)作用。(3)表觀遺傳學(xué)DNA甲基化機(jī)制參與了肺氣腫的發(fā)病機(jī)制。 第二章5-雜氮-2’-脫氧胞苷對香煙提取物所致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及其干細(xì)胞抗原-1表達(dá)的影響 目的：觀察干細(xì)胞抗原-1(Stem Cell Antigen-1, Sca-1)在正常小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)上的表達(dá),以及5-雜氮-2’-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, AZA)對香煙提取物(Cigarette Smoking Extract,CSE)所致EPCs功能及其Sca-1蛋白表達(dá)的影響。 方法：采用密度梯度離心法分離小鼠骨髓EPCs并培養(yǎng)；通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、對培養(yǎng)第7天的貼壁細(xì)胞行DiI-acLDL攝取及FITC-UEA-I結(jié)合雙染鑒定及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物,綜合鑒定EPCs;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCs上Sca-1的表達(dá)。 采用不同濃度和不同干預(yù)時間,用CSE溶液、AZA溶液體外干預(yù)培養(yǎng)7天的小鼠EPCs,采用噻唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測EPCs增殖能力,選擇最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時間進(jìn)行后續(xù)干預(yù)試驗。采用貼壁細(xì)胞計數(shù)檢測EPCs粘附能力,培養(yǎng)液中NO濃度測定檢測EPCs分泌能力。 將培養(yǎng)第7天的EPCs分為四組：正常EPCs組(對照組,N組),2umol/L AZA干預(yù)組(A組),1%CSE+2umol/L AZA干預(yù)組(AC組)和1%CSE干預(yù)組(C組),采用western-blot檢測各組Sca-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果：(1)培養(yǎng)7天的EPCs呈梭形、紡錘形或多邊形,可形成首尾相連網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu),亦可呈鋪路石樣外觀。其DiI-acLDL攝取及FITC-UEA-I結(jié)合雙染陽性率為(94.67±4.16)%,其特異性表面抗原FITC-CD34、PE-CD133、APC-Flk-1三陽表達(dá)率為(95.07±1.73)%,加上PerCP-Sca-1后的四陽表達(dá)率(94.00±1.67)%,其中EPCs的Sca-1陽性表達(dá)率為(98.87±0.24)%。 (2)(i)不同濃度和不同時間CSE干預(yù)后EPCs增殖能力比較：CSE干預(yù)3小時,與對照組比較,1%CSE和2.5%CSE組細(xì)胞OD值顯著增加(P0.05),5%CSE和10%CSE組細(xì)胞OD值顯著下降(P0.01)；CSE干預(yù)6小時,與對照組比較,1%CSE組細(xì)胞OD值顯著增加(P0.05),2.5%CSE、5%CSE和10%CSE組細(xì)胞OD值顯著下降(P0.01)；CSE干預(yù)24小時,與對照組比較,各CSE濃度干預(yù)均使細(xì)胞OD值下降(P0.01)。(ii)選擇1%CSE和干預(yù)24小時時間點(diǎn),比較不同濃度5-azaC干預(yù)后的EPCs增殖能力：與對照組比較,1%CSE組,1%CSE+2umol/L AZA組,1%CSE+5umol/LAZA組細(xì)胞OD值均下降(P0.05)；與1%CSE組比較,1%CSE+2umol/L AZA組,1%CSE+5umol/L AZA組細(xì)胞OD值增加(P0.05);1%CSE+2umol/L AZA組,1%CSE+5umol/L AZA組細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(iii)選擇1%CSE+2umol/LAZA和干預(yù)24小時時間點(diǎn),比較各組EPCs粘附能力和分泌能力：對照組(N組)、1%CSE+2umol/L AZA組(AC組)和1%CSE組(C組),EPCs貼壁細(xì)胞計數(shù)比較為：與N組比較,AC組和C組貼壁細(xì)胞數(shù)顯著降低(P0.01),與AC組比較,C組貼壁細(xì)胞數(shù)顯著降低(P0.01)。對照組(N組)、1%CSE+2umol/L AZA組(AC組)和1%CSE組(C組),EPCs培養(yǎng)液中NO濃度比較為：與N組比較,AC組和C組濃度顯著降低(P0.01),AC組和C組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 (3)正常EPCs組(對照組,N組),2umol/L AZA干預(yù)組(A組),1%CSE+2umol/L AZA干預(yù)組(AC組)和1%CSE干預(yù)組(C組)4組EPCs上Sca-1蛋白表達(dá)比較：與N組比較,C組Sca-1蛋白表達(dá)顯著降低(P0.01),AC組及A組Sca-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與C組比較,N組,AC組,A組Sca-1蛋白表達(dá)均顯著上升(P0.01)；AC組和A組之間Sca-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：(1)小鼠EPCs高表達(dá)Sca-1基因。(2)短時間低濃度的CSE干預(yù)使得EPCs的增殖功能代償性增強(qiáng),延長干預(yù)時間和／或提高干預(yù)濃度都將使EPCs的功能降低,甚至完全抑制,呈時間和濃度依賴。(3)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)CSE對EPCs上Sca-1蛋白表達(dá)的抑制作用,同時改善EPCs的功能,EPCs上Sca-1蛋白表達(dá)和EPCs功能改變趨勢一致,提示DNA甲基化參與了EPCs功能受損機(jī)制,Sca-1DNA甲基化可能參與了EPCs功能受損機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R563.3

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