本文選題：銅綠假單胞菌　切入點(diǎn)：多重耐藥　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分：PcrV被動(dòng)免疫在多重耐藥銅綠假單胞致細(xì)胞毒性的保護(hù)作用研究 目的：通過測(cè)定臨床分離的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system, T3SS)表達(dá)情況,比較耐藥組和敏感組菌株T3SS表達(dá)有無差異,應(yīng)用PcrV抗體,觀察PcrV被動(dòng)免疫對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌致細(xì)胞毒性是否有保護(hù)作用。 方法：隨機(jī)分離保存臨床分離的銅綠假單胞菌株,經(jīng)過隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)分析確認(rèn)為非同一克隆菌株,用微量肉湯稀釋法測(cè)定菌株對(duì)臨床常用抗假單胞菌抗生素的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)將菌株分為多重耐藥組和敏感組。應(yīng)用普通PCR和多重PCR擴(kuò)增T3SS的pcrV基因和毒素基因(exoU, exoS,exoY, exoT),比較T3SS的基因型在耐藥組和敏感組之間有無差異。Real-time PCR測(cè)定pcrV的相對(duì)表達(dá)水平,Western blot測(cè)定ExoU和ExoS的表達(dá),從而比較T3SS的表型在耐藥組和敏感組之間有無差異。應(yīng)用BEAS-2B細(xì)胞株,銅綠假單胞菌感染后,測(cè)定培養(yǎng)基中的LDH濃度,比較應(yīng)用PcrV抗體后,培養(yǎng)基中的LDH濃度有無變化,從而觀察PcrV被動(dòng)免疫對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌致細(xì)胞毒性有無保護(hù)作用。 結(jié)果：共分離出53株非同一克隆的臨床菌株,包括25個(gè)多重耐藥菌株和28株敏感菌株,pcrV, exoT, exoY幾乎在所有菌株中均為陽(yáng)性,exoU陽(yáng)性率在30%左右,exoS陽(yáng)性率在70%左右,兩組之間無顯著性差異；Real-time PCR比較之間pcrV相對(duì)表達(dá)無明顯差異,Western blot比較兩組之間ExoU,ExoS無顯著性差異。銅綠假單胞菌感染后,培養(yǎng)基中LDH顯著升高,應(yīng)用PcrV抗體后,LDH濃度有顯著下降,下降20%左右,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(P0.05)。 結(jié)論：銅綠假單胞菌的T3SS的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,在耐藥組和敏感組之間無明顯差異,PcrV被動(dòng)免疫后,細(xì)菌的毒力下降,對(duì)多重耐藥菌株致細(xì)胞毒性具有顯著保護(hù)作用,在銅綠假單胞菌日益顯著的耐藥問題上,T3SS可以作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn),有望解決日益嚴(yán)重的銅綠假單胞菌耐藥問題。 第二部分：PcrV被動(dòng)及主動(dòng)免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌致肺損傷的保護(hù)作用 目的：選擇一株多重耐藥銅綠假單胞菌株,體外分泌ExoU蛋白,建立多重耐藥銅綠假單胞菌感染的小鼠肺損傷模型,觀察PcrV被動(dòng)及主動(dòng)免疫對(duì)小鼠的生存與肺損傷是否具有保護(hù)作用。 方法：選擇第一部分中的R4菌株建立小鼠肺損傷模型,通過氣道內(nèi)滴入法(5×10＾6cfu菌株)制作小鼠肺損傷模型。實(shí)驗(yàn)分組：被動(dòng)免疫組,主動(dòng)免疫組,抗生素治療組,對(duì)照組。在感染后前12小時(shí),每小時(shí)記錄一次體溫,以后每24小時(shí)記錄一次體溫,觀察7天,觀察小鼠的生存率。另外,分別在感染后的6小時(shí)和12小時(shí)處死小鼠,檢測(cè)血液及肺組織細(xì)菌計(jì)數(shù)；檢測(cè)肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)和蛋白濃度；檢測(cè)濕干重比值(W/D)、髓過氧化物酶(MPO)活性；檢測(cè)MIP-2、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子含量；觀察肺組織病理。另外我們進(jìn)一步檢測(cè)分離出細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)和生物膜表達(dá)情況,觀察阻斷PcrV后是否會(huì)影響細(xì)菌的MIC和生物膜的表達(dá)情況。 結(jié)果：在R4感染后,對(duì)照組小鼠在7天內(nèi)死亡率為100%,應(yīng)用頭孢他啶(500mg/kg q12h腹腔注射)后,小鼠的生存時(shí)間得到一定的延長(zhǎng),但也均于7天內(nèi)死亡。應(yīng)用PcrV抗體(與細(xì)菌預(yù)混后同時(shí)打入小鼠肺內(nèi)),小鼠的生存率得到顯著改善。另外PcrV被動(dòng)免疫后,小鼠血中和肺內(nèi)的細(xì)菌計(jì)數(shù)較其他兩組有顯著降低,肺部炎癥顯著減輕,W/D降低,肺泡灌洗液中蛋白濃度降低,肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加,且小鼠肺MPO活性在早期有顯著增加,12小時(shí)后與其他兩組相近。與此同時(shí),PcrV被動(dòng)免疫后,小鼠血清內(nèi)MIP-2,IL-6,TNF-α水平降低,肺泡灌洗液中IL-6水平與其他兩組相似,MIP-2降低,TNF-α早期升高,12小時(shí)后降低。PcrV主動(dòng)免疫4周后,小鼠血清中PcrV抗體滴度在15-20μg/mL左右,此后感染R4,小鼠的生存率得到顯著改善。另外,阻斷PcrV后,細(xì)菌對(duì)頭孢他啶的MIC沒有變化,但是可以抑制細(xì)菌生物膜的表達(dá)。 結(jié)論：PcrV被動(dòng)免疫后,多重耐藥銅綠假單胞菌感染小鼠的生存率得到顯著改善,同時(shí)小鼠的肺損傷得到顯著減輕。PcrV主動(dòng)免疫四周后,小鼠體內(nèi)血清抗體滴度達(dá)到高峰,多重耐藥菌株感染后小鼠的生存率得到顯著改善。PcrV被動(dòng)及主動(dòng)免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌株感染中發(fā)揮保護(hù)作用。并且阻斷PcrV可以抑制細(xì)菌生物膜的形成,使細(xì)菌更易被清除。 第三部分：角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在銅綠假單胞菌致肺損傷的作用研究 目的：探討角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(keratinocyte growth factor-2, KGF-2)對(duì)銅綠假單胞菌致肺損傷的保護(hù)作用,及其對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。 方法：健康雄性Balb/c小鼠25g左右,分成3組,分組如下：1)無預(yù)處理組：無預(yù)處理,氣道內(nèi)滴入PBS60μl作為對(duì)照；2)對(duì)照組(control,C):氣道內(nèi)滴入銅綠假單胞菌(PAO1,1×10＾7cfu);3) KGF-2預(yù)處理組：動(dòng)物在感染前72小時(shí)氣道內(nèi)滴入KGF-25mg/kg之后在制作感染模型。在PAO1感染后,前12小時(shí),每小時(shí)記錄一次體溫,以后每24小時(shí)記錄一次體溫,觀察7天,觀察小鼠的生存率。另外,分別在感染后的6小時(shí)和12小時(shí)處死小鼠,取肺泡灌洗液,血漿,并留取肺組織。血液及肺組織細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)；分類計(jì)數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中的細(xì)胞,檢測(cè)BALF中的蛋白濃度。檢測(cè)MIP-2、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子含量;觀察肺組織病理。檢測(cè)KGF-2預(yù)處理對(duì)肺組織p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路活性的影響。體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)進(jìn)一步探討KGF-2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。 結(jié)果：在PAO1感染后,對(duì)照組小鼠在7天內(nèi)死亡率為90%左右,KGF-2預(yù)處理后,小鼠的生存率得到顯著改善。另外KGF-2預(yù)處理后,小鼠血中和肺內(nèi)的細(xì)菌計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著降低,肺部炎癥顯著減輕,W/D降低,BALF中蛋白濃度降低,肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。于此同時(shí),KGF-2預(yù)處理后,小鼠血清內(nèi)MIP-2,IL-6, TNF-α水平降低,肺泡灌洗液中也有所下降。KGF-2預(yù)處理顯著抑制了p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的活化。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),KGF-2增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能。 結(jié)論：KGF-2預(yù)處理能改善銅綠假單胞菌感染小鼠的生存率,同時(shí)減輕肺損傷程度,減輕炎癥反應(yīng)、水腫和出血。增強(qiáng)感染小鼠肺內(nèi)和血中細(xì)菌清除率,其保護(hù)機(jī)制一方面可能與抑制p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān),另一方面與增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Impaired upregulation of keratinocyte growth factor in injured lungs induced by Pseudomonas aeruginosa in immunosuppressed rats[J];Chinese Medical Journal;2006年17期

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本文編號(hào)：1630320