本文選題：小鼠　切入點：哮喘　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景近20年來,世界范圍內(nèi)的哮喘患病率呈上升趨勢,支氣管哮喘已成為全球最常見的慢性呼吸道疾病。據(jù)統(tǒng)計,我國約有2000～3000萬哮喘患者,且呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。臨床上對于哮喘的急性發(fā)作、治療以及對哮喘發(fā)作的預(yù)防工作尚未取到十分滿意效果。近年來,在臨床研究中我們發(fā)現(xiàn)與遺傳因素?zé)o明顯相關(guān)的非過敏性哮喘患病及診斷率存在上升趨勢,臨床治療效果較差,對患者生活質(zhì)量產(chǎn)生較大威脅。因此,對支氣管哮喘具體發(fā)病機制的深入探討、尋找新的治療手段以及預(yù)防哮喘的靶點方向,是呼吸系病學(xué)者在疾病研究中的重點和熱點。 支氣管哮喘作為一種呼吸系統(tǒng)常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病,其發(fā)病涉及多種炎癥細胞、炎性介質(zhì),血清Ig (Immunoglobulin) E增高、肺組織炎癥細胞浸潤、氣道高反應(yīng)性是其顯著的臨床表現(xiàn)。氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑是哮喘的三個顯著臨床特征。Thl/Th2免疫失衡是已被接受哮喘最重要的異常免疫學(xué)發(fā)病機制。大多數(shù)哮喘患者為過敏性哮喘,發(fā)病常與接觸變應(yīng)原有關(guān)。業(yè)已發(fā)現(xiàn),屋塵螨、細菌毒素、雞卵蛋白、木棉等都可認(rèn)為是變應(yīng)原,長期多次暴露于其中是哮喘主要的致病誘因。革蘭陰性細菌脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)就是其中的毒素之一。目前,有不少研究指出不同濃度的LPS可能會誘導(dǎo)不同程度的Th1、Th2免疫應(yīng)答反應(yīng),臨床研究尚未引起重視。Eisenbarth等研究發(fā)現(xiàn)低濃度(0.1μg/ml) LPS可誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2免疫應(yīng)答,而較高濃度(100μg/ml)LPS則偏向誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答,這一觀點證實LPS暴露水平高低可以決定機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的類型。同時,LPS能通過PRPs(pattern recognition receptors, PRRs)中的TLRs (Toll-like receptors)或NLRs(NOD-like receptors)導(dǎo)致IL(Interleukin)-1的釋放量增加,使幼稚T細胞偏向Th17細胞發(fā)展成熟。 氣道上皮細胞是除炎癥細胞和炎癥介質(zhì)之外參與氣道炎癥發(fā)生與發(fā)展的細胞層面結(jié)構(gòu)。研究證明,人氣道上皮細胞(human bronchial epithelial cell, HBE)除可以作為氣道的第一道防線發(fā)揮固有免疫作用外,在獲得性免疫激活與發(fā)展過程中也存在重要作用。近年來,炎癥復(fù)合體(Inflammasome)被認(rèn)為可能是多種炎癥性疾病獲得性免疫被激活的關(guān)鍵,其中被研究最多的就是NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain3)炎癥復(fù)合體。蛋白受體NLRP3、凋亡相關(guān)點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和半胱氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)共同組成的多蛋白復(fù)合體即是NLRP3炎癥復(fù)合體。其中的蛋白受體NLRP3能通過接頭蛋白ASC接合pro-Caspase-1,形成上述NLRP3inflammasome,受體信號的傳導(dǎo)可激活pro-Caspase-1,形成有活性的Caspase-1。而既往對炎癥復(fù)合體的研究證實,Caspase-1是促進IL-1家族細胞因子成熟與釋放的關(guān)鍵酶水解因素,從而使IL-1家族細胞因子參與后續(xù)炎癥因子分泌及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。 本課題選擇BALB/c小鼠和人氣道上皮細胞(16HBE)作為研究對象,利用動物模型及體外實驗觀察哮喘小鼠模型及人氣道上皮細胞中接頭蛋白ASC的表達情況及下游細胞因子IL-1p的分泌情況,并通過siRNA技術(shù)阻斷ASC在16HBE中的表達,觀察其對Caspase-1、IL-1β表達的改變,證實ASC在氣道炎癥中的作用,從而為完善哮喘氣道炎癥機制研究提供參考。 目的建立OVA致敏和激發(fā)BALB/c雌性小鼠哮喘模型,觀察LPS處理模型建立后與前者有無不同。 方法SPF級雌性BALB/c小鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)24只,隨機分為3組,每組小鼠各8只,分別為PBS對照組(A)、哮喘組(B), LPS干預(yù)組(C)。以去蛋白飼料和普通飲用水分籠飼養(yǎng)。各組小鼠分別于第0、7、14天進行致敏：A組小鼠以生理鹽水200μl腹腔注射,B、C組小鼠以V級OVA溶液200μl腹腔注射,其中C組小鼠在第18-20天另予10μg LPS溶液腹腔注射。第21天起將各組小鼠置于玻璃霧化吸入瓶中,由WH-2000超聲波化器提供動力,A組以40ml PBS溶液霧化吸入,B、C組以Ⅱ級OVA40ml霧化吸入。每次激發(fā)時間30min,連續(xù)霧化7天。注意觀察并記錄造模期間小鼠食量、行為學(xué)等方面變化。末次激發(fā)24h后,以乙酰甲膽堿霧化各組小鼠,用BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀檢測小鼠氣道反應(yīng)性監(jiān)測指標(biāo)增強呼氣間歇(Penh)值。行支氣管肺泡灌洗術(shù),將肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中細胞沉渣取出進行細胞計數(shù)；涂片并染色計數(shù)細胞分類；取右上肺(未灌洗),作石蠟切片行常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài),氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤情況。 結(jié)果 1.模型制備中小鼠行為學(xué)觀察：在致敏及激發(fā)過程中觀察小鼠反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)A組無明顯異常癥狀,B、C組小鼠出現(xiàn)典型哮喘發(fā)作癥狀,如煩躁不安、二便失禁、口唇紫紺、流涎、呼吸急促等,以上可證實模型制作成功。 2.無創(chuàng)肺功能檢測氣道反應(yīng)性結(jié)果：各組小鼠經(jīng)氣道反應(yīng)性檢測,其氣道高反應(yīng)性由呼吸間歇值(Penh)表達。從基線值開始按濃度順序激發(fā),到乙酰甲膽堿濃度為3.125mg/ml時,三組小鼠的Penh值變化無統(tǒng)計學(xué)差異,其P0.05；而當(dāng)乙酰甲膽堿濃度為6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml和50mg/ml時,各組Penh值比較,B組明顯高于A組和C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。 3.BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞百分比、中性粒細胞百分比：①BALF細胞計數(shù)：B組為(54.60±0.67)×104/ml高于A組為(11.55±0.69)×104/ml:C組為(73.45±0.75)×104/ml,明顯高于A、B兩組(其中F=57.421,P=0.000)。②BALF嗜酸性粒細胞百分?jǐn)?shù)：A組為(5.06±2.10)%,B組為(17.96±4.46)%,C組為(11.20±0.48)%,A、B與A、C間比較,P0.05,差別有統(tǒng)計學(xué)意義；而B、C間比較,P=0.156,二者間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。③BALF中性粒細胞百分?jǐn)?shù)：A組(7.41＋0.94)%,B組：(12.9±0.69)%,C組：(17.03＋0.57)%。各組間比較P0.05,差別有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果：A組小鼠肺組織基本無炎癥浸潤；B組可見炎癥反應(yīng)；C組小鼠細支氣管壁腫脹,其周圍可見大量炎癥細胞浸潤,并有杯狀細胞增生,較B組炎癥有所加重。 結(jié)論雌性BALB/c小鼠以O(shè)VA腹腔注射致敏并霧化激發(fā)的方法可成功建立小鼠哮喘模型,其氣道炎癥符合哮喘的病理生理改變。10μg劑量LPS可加重哮喘小鼠氣道上皮炎癥,使傳統(tǒng)哮喘模型向非嗜酸性粒細胞型轉(zhuǎn)向。 第二部分哮喘小鼠肺部ASC表達情況和L-1p的分泌 目的觀察哮喘小鼠肺部ASC表達情況和下游細胞因子L-1p的釋放情況,探討ASC影響炎癥表達的可能機制。 方法 1.取第一部分各組小鼠肺組織的石蠟切片脫蠟、水化,經(jīng)抗原修復(fù)、抗體結(jié)合、蘇木素復(fù)染等步驟后封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織中ASC的主要表達部位及表達量。 2. BALF液離心后取上清,參照酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒說明書進行IL-1p檢測。 結(jié)果 1.炎癥復(fù)合體中ASC在肺組織中表達情況：對比A、B、C各組,B組小鼠氣道上皮中ASC表達高于A組,而予LPS刺激的C組,其氣道上皮中ASC的表達情況則明顯高于A、B組。 2.IL-1p的分泌：C組BALF上清IL-1β(9.45±1.20) pg/mg,明顯高于B組(4.97±1.23)pg/mg及A組(3.11±0.98)pg/mg,各組間P0.05,差別有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論ASC參與哮喘中炎癥反應(yīng)的發(fā)生；10μg劑量LPS可加重哮喘小鼠氣道上皮炎癥,并使ASC在哮喘炎癥中的參與量增加。 第三部分siRNA干擾人氣道上皮細胞ASC表達后對Caspase-1、IL-1β影響研究 目的對人氣道上皮細胞中ASC靶向干擾,檢測干擾效果,篩選出最有效的干擾序列。觀察LPS誘導(dǎo)干擾前后的16HBE細胞中Caspase-1、IL-1β蛋白表達情況的影響。 方法以ASC為目標(biāo)基因,設(shè)計并合成三條ASC-siRNA序列,lipofecamineTM NAiMAX為媒介轉(zhuǎn)染至細胞,用Realtime-PCR和Western blot技術(shù)檢測不同沉默序列對ASCmRNA及蛋白表達的影響。取有效干擾組、空白組為實驗對象,分別予以下處理：①PBS空白對照處理；②LPS組：加LPS(100ng/ml)培養(yǎng)18h；③ATP組：外源性ATP(5mmol/L)處理2h；④LPS+ATP組：外源性ATP (5mmol/L)預(yù)處理2h后再加入LPS (100ng/ml)培養(yǎng)至18h。Western blot檢測各組細胞Caspase-1、IL-1β的表達。結(jié)果 1.ASC-siRNA序列片段經(jīng)lipofecamineTM RNAiMAX轉(zhuǎn)染16HBE細胞后,ASCmRNA及蛋白表達較對照組明顯降低。ASC-siRNA-499干擾序列,轉(zhuǎn)染濃度2μg/ml、轉(zhuǎn)染時間48h (ASC mRNA)及72h(蛋白)表達較其他(序列/濃度/時間)組別明顯降低。 2.單純ATP刺激正常細胞,后續(xù)炎癥因子Caspase-1、IL-10較空白對照組無明顯不同；而相比單獨使用LPS刺激的正常細胞,以ATP預(yù)處理2h再使用LPS刺激后,該組所能檢測到的Caspase-1及IL-1β量較之增多,其中Caspase-1增多較明顯；以ASC-siRNA-499干擾后的細胞,單純LPS、LPS聯(lián)合ATP處理,所得到的炎癥因子Caspase-1、IL-1β都較非干擾細胞減弱。 結(jié)論LPS、外源性ATP以第一、二信號方式參與氣道上皮細胞中NLRP3炎癥復(fù)合體的活化過程,NLRP3炎癥復(fù)合體中的ASC參與caspase-1活化量與炎癥因子IL-1p分泌量的調(diào)控。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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1 李睿;劉恩梅;楊錫強;王莉佳;;不同飼養(yǎng)環(huán)境、種屬、佐劑及激發(fā)方法對小鼠哮喘炎癥的影響[J];重慶醫(yī)學(xué);2006年01期

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本文編號：1608429