本文選題：M2巨噬細(xì)胞　切入點：M-CSF　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS),是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)多器官功能障礙綜合征(MODS)中肺部的首要表現(xiàn),常由創(chuàng)傷、燒傷、感染、休克等多種因素所誘發(fā),病情嚴(yán)重且進(jìn)展迅速。近年來,眾多學(xué)者圍繞ALI/ARDS的發(fā)病機制和防治策略進(jìn)行了廣泛的研究,但仍缺乏快速高效的治療方案,發(fā)病率和死亡率仍居高不下。巨噬細(xì)胞是機體免疫防御系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞之一,其在機體的免疫監(jiān)視、免疫引發(fā)和病原清除中均擔(dān)任重要角色,可以識別侵入機體的致病原,并誘發(fā)免疫反應(yīng)以達(dá)到清除致病原的作用。有研究發(fā)現(xiàn),在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展的過程中,巨噬細(xì)胞的大量激活和后期凋亡均與其病理改變有著密切聯(lián)系。早期在體內(nèi)外各類病原刺激物的作用下,M1型巨噬細(xì)胞大量激活,分泌各類促炎性細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì),使中性粒細(xì)胞大量活化并遷移至炎癥部位,促進(jìn)肺部炎癥爆發(fā)且導(dǎo)致肺部組織損傷,肺血管通透性增加,產(chǎn)生肺水腫。在肺損傷的晚期,巨噬細(xì)胞更多地呈現(xiàn)為M2型,功能主要在于抑制炎癥反應(yīng),吞噬中性粒細(xì)胞,分泌抗炎性細(xì)胞因子和介質(zhì),促進(jìn)膠原合成和傷口修復(fù)等。但若前述過度激活的炎癥反應(yīng)發(fā)生失控,巨噬細(xì)胞在促炎和抑炎的過程中功能失衡。吞噬了中性粒細(xì)胞的巨噬細(xì)胞功能下降,并可發(fā)生凋亡或細(xì)胞焦亡等形式的程序性死亡,使巨噬細(xì)胞數(shù)量減少,機體的抗炎功能進(jìn)一步降低,肺部炎癥和組織損傷進(jìn)一步加重。因此,明確巨噬細(xì)胞在急性肺損傷中發(fā)生發(fā)展中的作用特點和機制,對于探索肺損傷的治療方案有著重要的啟示和作用。在本課題中,首先利用C57BL/6小鼠,培養(yǎng)并獲取骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞,隨后進(jìn)行小鼠體內(nèi)的干預(yù)治療,觀察外源性的M2型巨噬細(xì)胞補充對肺損傷小鼠肺部炎癥因子、細(xì)胞浸潤、蛋白滲出、水腫和肺組織病理損傷的影響和規(guī)律。最后,根據(jù)變化特點,通過體外培養(yǎng)和抗體阻斷相結(jié)合等方法,進(jìn)一步探索其所引起變化的可能和潛在機制。第一部分骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定目的用骨髓細(xì)胞分化的方法培養(yǎng)出符合實驗要求的骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞。方法1.選取4-5 w的健康雄性野生型C57BL/6小鼠,處死后收集下肢股骨和近端脛骨骨髓腔內(nèi)的原始骨髓細(xì)胞,給予巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF誘導(dǎo)分化7天后,更換為細(xì)胞因子IL-4分化1天,獲得骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞。2.收集培養(yǎng)獲得的M2型巨噬細(xì)胞,以F4/80抗體和CD206抗體作為標(biāo)記,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)所得的M2型巨噬細(xì)胞的純度。結(jié)果給予M-CSF、IL-4誘導(dǎo)分化原始骨髓細(xì)胞,得到M2型巨噬細(xì)胞。該細(xì)胞生長狀態(tài)良好,鏡下形態(tài)滿意。經(jīng)流式檢測后M2型巨噬細(xì)胞純度理想,可到90%以上,滿足實驗要求。結(jié)論骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功,后續(xù)試驗可順利進(jìn)行。第二部分M2型巨噬細(xì)胞對急性肺損傷小鼠肺部的保護(hù)作用目的探索M2型巨噬細(xì)胞對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部炎癥反應(yīng)和病理損傷的影響。方法取6-8w的C57BL/6小鼠按每組6只的方式隨機分為3組:假手術(shù)(Sham)組,模型(LPS)組和細(xì)胞治療(M2)組。經(jīng)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)ALI模型后3h,M2組小鼠經(jīng)肺內(nèi)給予無菌M2型巨噬細(xì)胞懸液輸注。分別在肺損傷造模后6h、24h處死小鼠,獲得肺損傷小鼠的肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)待后續(xù)檢測。1.流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行BALF中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞計數(shù)。2.BCA法檢測BALF中蛋白濃度。3.ELISA法檢測BALF中細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-10的分泌。4.對小鼠肺組織進(jìn)行干濕比稱重計算。5.將小鼠肺組織做石蠟切片進(jìn)行HE染色,然后行病理學(xué)評分。結(jié)果1.在術(shù)后6h和24h,M2組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞較LPS組明顯減少;在術(shù)后24h,M2組小鼠BALF中T細(xì)胞較LPS組增加(P0.05)。2.在肺損傷后6h和24h,M2組小鼠BALF中蛋白濃度較LPS組明顯降低(P0.05)。3.在6h和24h,M2組較之LPS組,BALF中促炎性細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β水平均有明顯降低,而抑炎性細(xì)胞因子IL-10分泌增加(P0.05)。4.在肺損傷后6h,M2組與LPS組干濕比未無差異;但在術(shù)后24h,M2組小鼠肺組織干濕比較LPS組明顯降低,證明肺水腫得到緩解(P0.05)。5.在肺損傷后6h和24h,M2組小鼠肺部的病理損傷均較LPS組均有明顯減輕,病理評分顯著降低(P0.05)。結(jié)論骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞對急性肺損傷小鼠的肺部具有保護(hù)作用。M2型巨噬細(xì)胞可以緩解小鼠肺部病理損傷,降低富蛋白液的滲出,減少中性粒細(xì)胞浸潤,調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分泌。第三部分M2型巨噬細(xì)胞對小鼠肺部保護(hù)作用的機制研究目的探討骨髓源性M2型巨噬細(xì)胞對小鼠急性肺損傷保護(hù)作用的可能機制。方法1.將培養(yǎng)所得的M0和M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行消化計數(shù)后,按照[M0/M2]細(xì)胞數(shù)[1:10]、[1:1]、[10:1]的不同比例進(jìn)行混合共培養(yǎng),給予LPS刺激24h后,收集上清,ELISA檢測細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β和IL-10的表達(dá)水平。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞表面PD-L1分子的表達(dá)。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞治療后BALF中T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。4.將小鼠隨機分為4組:假手術(shù)(Sham)組,模型(LPS)組,Isotype抗體(Isotype)組和Anti-PD-L1抗體(Anti-PD-L1)組。經(jīng)LPS造模后3h,Anti-PD-L1組予Anti-PD-L1抗體肺內(nèi)滴注后,同時予以M2型巨噬細(xì)胞輸注。在肺損傷24h處死小鼠收取BALF,檢測細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β和IL-10的濃度。結(jié)果1.M0/M2共培養(yǎng)結(jié)果顯示:伴隨著M2型巨噬細(xì)胞比例的增加,促炎性細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β的分泌逐漸降低;同時,M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加同時,抑炎性細(xì)胞因子IL-10的分泌也呈現(xiàn)出降低趨勢(P0.05)。2.M2型巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1分子,其陽性率達(dá)99%±1.8%以上。3.M2型巨噬細(xì)胞治療后BALF中T細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1分子,陽性率達(dá)95%±4.1%以上。4.在阻斷PD-L1信號再輸注M2型巨噬細(xì)胞,小鼠肺部炎癥因子并未得到降低,反而有升高趨勢。阻斷PD-L1分子小鼠肺部細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β分泌增加(P0.05)。結(jié)論M2型巨噬細(xì)胞可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌。M2型巨噬細(xì)胞可能并非直接通過IL-10途徑發(fā)揮抗炎作用的主要機制。M2型巨噬細(xì)胞的肺部保護(hù)作用可能與PD-1/PDL1信號通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R563.8

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本文編號：1578573