發(fā)布時間：2018-03-07 02:27

  本文選題：肺纖維化　切入點(diǎn)：雷帕霉素　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： mTOR信號通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生存、凋亡等重要功能的信號途徑之一,目前研究表明該通路與多種纖維化疾病相關(guān)。特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種致死性的缺乏有效藥物治療的慢性肺病,有研究提示mTOR信號通路異�？赡芘c特發(fā)性肺纖維化發(fā)病相關(guān),但具體機(jī)制尚不明確。 研究目的： 研究肺肌成纖維細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路活化情況在肺纖維化發(fā)病中的作用,探討mTOR特異性抑制劑雷帕霉素對肺纖維化形成過程的干預(yù),并闡述其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。 研究方法： 1.在IPF患者肺組織中,使用免疫組織化學(xué)染色方法,檢測反映mTOR通路活化的效應(yīng)蛋白p-S6在肺組織內(nèi)的表達(dá)情況； 2.在野生C57BL/6小鼠中,應(yīng)用單次氣管內(nèi)注射博來霉素的方法建立小鼠肺纖維化模型,用免疫組織化學(xué)染色方法來檢測此模型小鼠肺組織中p-S6的表達(dá)情況； 3.從正常肺組織中分離原代肺成纖維細(xì)胞(primary lung fibroblast, PLF)做體外原代細(xì)胞培養(yǎng),在TGF-β1刺激下,肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,檢測此過程中p-S6的表達(dá)變化情況； 4.應(yīng)用一種人胚胎肺成纖維細(xì)胞系(MRC5)做細(xì)胞培養(yǎng),在TGF-β1刺激下,成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,檢測此過程中的p-S6表達(dá)變化情況； 5.通過轉(zhuǎn)基因及基因敲除的技術(shù)方法建立一種在肺泡上皮內(nèi)特異性TSC1基因敲除的小鼠動物模型,使得該小鼠2型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路過度活化,應(yīng)用此種基因敲除小鼠來進(jìn)行博來霉素所致肺纖維化模型的構(gòu)建,評估在肺泡上皮內(nèi)mTOR過度活化情況下對肺纖維化形成的影響； 6.在野生C57BL/6小鼠中,使用mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素來干預(yù)博來霉素所致的肺纖維化過程,分別使用了雷帕霉素預(yù)處理(氣管給藥前第5天)及雷帕霉素后期治療(氣管給藥后第8天)兩種干預(yù)方式,主要評估藥物干預(yù)下的小鼠體重、死亡率及肺組織病理損傷的變化情況； 7.在野生C57BL/6小鼠中,聯(lián)合使用雷帕霉素和氯喹(作為一種自噬抑制劑)的預(yù)處理方式干預(yù)博來霉素所致的肺纖維化過程,觀察小鼠死亡率情況,并使用WB蛋白檢測及電鏡觀察方式來評估小鼠肺組織內(nèi)的自噬水平變化情況。 研究結(jié)果： 1.p-S6在IPF患者肺組織成纖維細(xì)胞灶中的肌成纖維細(xì)胞內(nèi)明顯高表達(dá)； 2.p-S6在博來霉素所致肺纖維化模型的小鼠纖維化病變肺組織中明顯高表達(dá); 3.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,成纖維細(xì)胞(包括人肺組織原代培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞和人胚胎肺成纖維細(xì)胞)在TGF-β1的刺激下均可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞(a-SMA表達(dá)升高),此過程中p-S6表達(dá)明顯升高。 4.在小鼠肺組織中,肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)TSC1基因敲除能導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路過度活化,肺泡上皮內(nèi)mTOR活化能加重博來霉素所致小鼠肺組織病理損傷和死亡； 5.雷帕霉素預(yù)處理干預(yù)方式能有效改善博來霉素所致的肺病理損傷并降低死亡率,雷帕霉素后期處理干預(yù)方式不能改善博來霉素所致的肺病理損傷及不能降低死亡率； 6.聯(lián)合使用雷帕霉素和氯喹預(yù)處理干預(yù)方式同單純使用雷帕霉素預(yù)處理干預(yù)相比,能加重博來霉素所致的小鼠死亡；博來霉素所致肺纖維化的小鼠肺組織中自噬水平下降,雷帕霉素干預(yù)能促進(jìn)肺組織中的自噬水平,氯喹則降低其自噬水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1.肺纖維化發(fā)病時肺內(nèi)肌成纖維細(xì)胞的形成過程中伴隨著mTOR信號通路的活化。 2.肺組織肺泡上皮內(nèi)mTOR信號通路活化參與肺纖維化發(fā)病。 3. mTOR抑制劑雷帕霉素對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化過程能起到一定的抑制作用。 4.肺纖維化時自噬水平低下,雷帕霉素可能是通過抑制mTOR信號通路和促進(jìn)自噬的機(jī)制來發(fā)揮治療作用。
[Abstract]:Research background:
MTOR signal pathway is the regulation of cell proliferation, cell survival, one of the important functions of the signal pathway of apoptosis, the present study shows that the pathway and a variety of fibrotic diseases. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lack of effective drug for the treatment of chronic lung disease, a study suggests possible and idiopathic pulmonary fibrosis the incidence of abnormal mTOR signal pathway, but the mechanism is not clear.
The purpose of the study is:
Objective to investigate the role of activation of mTOR signaling pathway in pulmonary fibroblasts and alveolar epithelial cells in the pathogenesis of pulmonary fibrosis, and to explore the intervention of rapamycin, a specific inhibitor of mTOR, on the formation process of pulmonary fibrosis, and to expound the possible mechanism of its action.
Research methods:
1. in the lung tissue of IPF patients, immunohistochemical staining was used to detect the expression of the effector protein p-S6, which reflected the activation of the mTOR pathway in the lung tissue.
2. in the wild C57BL/6 mice, a single lung endotracheal injection of bleomycin was used to establish the mouse pulmonary fibrosis model. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of p-S6 in the lung tissue of the model mice.
3., primary lung fibroblast (PLF) from primary lung tissue was isolated from normal lung tissues and cultured in vitro, and TGF- fibroblasts were transformed to myofibroblast stimulated by TGF- 1, and the expression of p-S6 in the process was detected.
4., a human embryonic lung fibroblast cell line (MRC5) was used for cell culture. Fibroblasts were differentiated into myofibroblasts under the stimulation of TGF- beta 1, and the expression of p-S6 in the process was detected.
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本文編號：1577557