本文選題：A549　切入點(diǎn)：MHV-68　出處：《華中科技大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分MHV-68體外對(duì)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)化的確切影響 【目的】觀察MHV-68體外對(duì)A549細(xì)胞上皮間質(zhì)化的確切影響，為我們的后期研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【方法】 A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為四大組，分別為A組：空白對(duì)照組；B組：MHV-68干預(yù)組；C組：TGF-β1陽(yáng)性對(duì)照組，D組：RSV干預(yù)組。每一組都設(shè)24h,48h,72h,96h四個(gè)亞組。運(yùn)用相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin, α-SMA在細(xì)胞里的表達(dá)情況，Western blot法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin, α-SMA在蛋白水平中的表達(dá)情況。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)水平。 【結(jié)果】顯微鏡鏡下觀察MHV-68干預(yù)組的A549細(xì)胞在干預(yù)后48h出現(xiàn)形態(tài)變化，在72h時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化更為顯著，表現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)梭型，并出現(xiàn)分叉，細(xì)胞間連接疏松。而空白對(duì)照組的A549呈典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間連接緊密，鏡下呈鵝卵石樣生長(zhǎng)。細(xì)胞免疫熒光顯示上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin在MHV-68干預(yù)72h后明顯減少，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA在MHV-68干預(yù)后72h明顯增加（P＜0.05）。Western blot結(jié)果與細(xì)胞免疫熒光結(jié)果一致。ELISA結(jié)果顯示MHV-68干預(yù)組的培養(yǎng)基上清中TGF-β1的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加（P＜0.05）。同時(shí)，RSV干預(yù)組與空白對(duì)照組間的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異。 【結(jié)論】 MHV-68體外可以誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549出現(xiàn)EMT樣改變，其可能機(jī)制與MHV-68促A549細(xì)胞分泌TGF-β1增多有關(guān)，與之對(duì)照的RSV體外不能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT。 第二部分首創(chuàng)MHV-68干預(yù)老年吸煙小鼠所致CPFE模型 【目的】首創(chuàng)MHV-68干預(yù)老年吸煙小鼠所致CPFE模型，為進(jìn)一步MHV-68在CPFE形成中的可能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 【方法】48只清潔級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為8組，每組6只:A組（正常對(duì)照組），B組（COPD組），C組：C1組（COPD+MHV68，7天），C2組（COPD+MHV-68，14天），C3組（COPD+MHV-68，21天），C4組（COPD+MHV-68，28天），D組（COPD+RSV，28天）, E組(COPD+博來(lái)霉素組)。通過(guò)香煙煙霧熏染12月制造COPD模型，采用肺組織石蠟切片HE染色，肺泡灌洗液中總細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)肺組織病理變化及炎癥浸潤(rùn)情況，肺組織石蠟切片Masson染色來(lái)評(píng)價(jià)肺組織膠原沉積情況。ELISA檢測(cè)纖維化相關(guān)重塑因子TGF-β1的蛋白表達(dá)水平。 【結(jié)果】肺組織切片HE染色可觀察到，與A組相比，其余各組均出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，肺泡融合，肺大皰，在炎癥方面，E組炎癥最為顯著，C組次之，B組與D組的炎癥浸潤(rùn)較A組無(wú)明顯差別。在C組各亞組中可觀察到，相對(duì)C1組，C3，C4組的炎癥浸潤(rùn)顯著增多，C2組炎癥輕度增加。BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)可發(fā)現(xiàn)，相對(duì)A組，其余各組肺泡灌洗液中的炎性細(xì)胞總數(shù)均顯著增加，其中E組最高，C組次之，B組與D組之間無(wú)明顯差別。Masson染色可觀察到，與A組相比，C組與E組肺組織膠原沉積明顯增多，且E組膠原沉積較C組更為顯著，而A組，B組跟E組三者之間無(wú)明顯差異。ELISA結(jié)果提示，C組，E組小鼠BALF中TGF-β1的蛋白表達(dá)水平較A組明顯增加（P＜0.05），B組，，D組小鼠的TGF-β1較A組也有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組，E組的TGF-β1的增加較B組，D組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 【結(jié)論】 MHV-68干預(yù)老年吸煙小鼠可以成功復(fù)制CPFE模型，不同時(shí)間段的病理改變提示所發(fā)生的纖維化可能與MHV-68對(duì)氣道的炎癥損傷及促使氣道重塑因子TGF-β1表達(dá)增多有關(guān)，而RSV在體內(nèi)不能導(dǎo)致COPD小鼠形成CPFE的病理改變。 第三部分糖皮質(zhì)激素DXM對(duì)MHV-68所致小鼠CPFE模型的影響 【目的】觀察DXM對(duì)MHV-68所致小鼠CPFE模型是否起到抑制作用，并分析其原因。 【方法】12只清潔級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分成二組，每組6只（n=6）：A組（COPD+MHV-68），B組（COPD+MHV-68+DXM）。采用肺組織石蠟切片HE染色，肺泡灌洗液中總細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)肺部炎癥浸潤(rùn)情況，切片Masson染色來(lái)評(píng)價(jià)肺組織膠原沉積情況。ELISA檢測(cè)纖維化相關(guān)重塑因子TGF-β1的蛋白表達(dá)水平。 【結(jié)果】肺組織切片HE染色及BALF炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)可觀察到，B組炎癥浸潤(rùn)程度較A組明顯減輕，Masson染色提示B組肺組織膠原沉積較A組明顯減少。ELISA結(jié)果顯示B組TGF-β1水平明顯下降（P＜0.05）。 【結(jié)論】 DXM治療可抑制MHV-68感染的老年肺氣腫小鼠向CPFE方向進(jìn)展，其可能機(jī)制在于DXM對(duì)氣道炎癥和氣道重塑因子TGF-β1的抑制。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

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1 梁先萬(wàn),王興勝,畢玉田,王耀麗,唐肇普;COPD合并肺間質(zhì)纖維化的特點(diǎn)及其臨床意義[J];重慶醫(yī)學(xué);2003年07期

本文編號(hào)：1568512