本文選題：香煙煙霧　切入點：戒煙　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景及目的 白介素-22(IL-22)屬于白介素-10(IL-10)細胞因子家族成員,同時具有促進炎癥及抗炎雙重性質,各種不同因素的作用下,IL-22發(fā)揮不同的生物學效應,包括IL-22在局部濃度水平、作用時間的長短以及其所發(fā)揮作用的細胞因子網絡環(huán)境等。香煙暴露(CS)是多種氣道疾病發(fā)生和發(fā)展的重要危險因素,而且,即使戒煙后,這種影響仍繼續(xù)延續(xù),即氣道炎癥仍然存在。盡管有關IL-22在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究不少,如在博裂霉素誘導的肺纖維化模型中表現(xiàn)出保護作用。然而,IL-22在CS誘導的肺部炎癥中的機制尚不清楚。因此,本研究擬通過CS誘導小鼠肺部炎癥模型,給予IL-22干預,研究IL-22干預對香煙誘導小鼠肺部炎癥的作用及機制。同時擬通過戒煙小鼠動物模型,觀察戒煙后小鼠肺部炎癥以及相關趨化因子及細胞因子的變化并探討其機制。 方法 1.雄性C57BL/6小鼠,隨機分為正常對照組(Control).香煙暴露組(CS). IL-22組(IL-22)、IL-22+香煙暴露組(IL-22+CS)及戒煙組(SC),每組各6只。(1)CS組小鼠每天置于艙內,香煙暴露前半小時腹腔注射等體積生理鹽水,每次5支香煙,每天4次,兩次間隔30分鐘,連續(xù)暴露3天；(2)正常對照組小鼠暴露于過濾空氣,除香煙暴露外,其他條件同CS組；(3)IL-22組小鼠暴露于過濾空氣,腹腔注射rhIL-22(按100μg/kg體重劑量),除香煙暴露外,其他條件同正常對照組；(4)IL-22+CS組小鼠除香煙暴露前半小時腹腔注射rhIL-22(按100μg/kg體重劑量)外,其他條件同CS組；(5)SC組小鼠前3天條件同CS組,第4天起暴露于過濾空氣,1周后處死小鼠。 2.采用Flexivent小鼠肺功能儀,測量小鼠組織衰減(G)、組織彈性(H)及氣道阻力(Rn)。 3.通過HE及Masson染色觀察肺部形態(tài)、炎癥及氣道周圍膠原蛋白沉積情況,并進行病理評分。 4.使用光學顯微鏡計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細胞總數(shù)以及通過細胞甩片HE染色進行細胞分類。 5.采用Real-Time PCR方法及免疫組織化學檢測小鼠肺組織中趨化因子CXC基序受體3CCXCR3)配體、基質金屬蛋白酶(MMPs)、白介素-17A(IL-17A)及轉化生長因子-β1(TGF-β1) mRNA及蛋白表達水平。 6.應用ELISA法測量BALF上清中CXCR3配體、IL-22、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-a)及TGF-β1濃度。 結果 第一部1L-22對香煙誘導小鼠肺部炎癥的作用及機制 1.肺功能CS組、IL-22組及IL-22+CS與正常對照組比較,Rn顯著增加(0.67±0.08cmH2O.s/ml、0.68±0.08cmH2O.s/ml及0.78±0.10cmH2O.s/ml vs0.52±0.03cmH2O.s/ml,P值分別小于0.01、0.01及0.001)；而G和H則顯著降低(G:7.60±0.64cmH2O/ml、6.78±0.89cmH2O/ml及5.59±0.57cmH2O/ml vs9.31±1.89cmH20/ml,P值分別小于0.05、0.01及0.001；H:32.10±2.59cmH2O/ml,28.52±2.22cmH2O/ml及25.66±2.54cmH2O/ml vs46.20±8.11cmH20/ml,P值均小于0.001)。IL-22+CS組與CS組比較,Rn顯著升高(P0.05),而G和H則顯著降低(P值分別小于0.01和0.05)。 2.肺組織病理學評分結果光鏡下可見CS組和IL-22+CS組出現(xiàn)上皮損傷、小氣道壁及肺實質炎細胞浸潤、鱗狀上皮化生以及膠原蛋白沉積等。根據(jù)病理評分標準,CS組、IL-22組及IL-22+CS組與正常對照組比較,病理總評分均顯著增高(4.83±1.47、2.67±±0.52及7.00±0.89vs1.33±0.52,P值分別小于0.001、0.05及0.001), IL-22+CS組與CS組比較,病理總評分亦顯著增加(P0.01)。 3. BALF炎癥細胞總數(shù)及分類CS組、IL-22組及IL-22+CS組的炎癥細胞總數(shù)顯著高于正常對照組(16.75±0.88*104/ml、13.08±0.82*104/ml及22.04±1.34*104/ml vs6.25±0.97*104/ml,P值均小于0.001)。IL-22+CS組炎癥細胞總數(shù)顯著高于CS組比較(P0.001)。在增加的炎癥細胞中,以巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞為主。 4.肺組織趨化因子或細胞因子mRNA表達水平CS組、IL-22組及IL-22+CS組較正常對照組,以下趨化因子mRNA表達水平顯著升高：CXCL9(P值分別小于0.01、0.001及0.01)；CXCL10(P值分別小于0.05、0.05及0.001);而CXCL11僅在IL-22+CS組顯著升高(P0.01),余差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),此外IL-22+CS組CXCL10和CXCL11mRNA表達水平顯著高于CS組(P值均小于0.01)。TGF-β1和IL-17A mRNA表達水平僅在CS組和IL-22+CS組顯著高于正常對照組(TGF-β1:P值分別小于0.01和0.001；IL-17A:P值均小于0.001),其中IL-22+CS組TGF-β1mRNA表達水平顯著高于CS組(P0.05)。 5.肺組織趨化因子或細胞因子蛋白表達水平與正常對照組相比較,CS組和IL-22+CS組在以下趨化因子或細胞因子蛋白表達水平顯著升高：CXCL9(3.17±0.41和3.50±±0.55vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；CXCL10(2.17±0.41和2.83±0.75vs1.17±0.41,P值分別小于0.01和0.001); CXCL11(3.17±0.41和3.17±0.41vs1.50±0.55,P值均小于0.001),此外IL-22+CS組CXCL10蛋白表達水平顯著高于CS組(P0.05)；TGF-β1(2.67±0.52和3.67±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001),其中IL-22+CS組TGF-β1顯著高于CS組(P0.01); IL-17A(3.17±0.41和3.33±0.52vs1.67±0.52,P值均小于0.001),而IL-17A在這兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6. BALF趨化因子或細胞因子濃度CS組和IL-22+CS組與正常對照組比較,以下細胞因子或趨化因子濃度顯著增加：CXCL9(75.13±8.63pg/ml和85.04±8.32pg/ml vs66.33±5.40pg/ml,P值分別小于0.05和0.001)；CXCL10(143.86±5.43pg/ml和152.90±9.34pg/ml vs104.15±4.86pg/ml,P值均小于0.001); CXCL11(53.67±5.26pg/ml和56.34±3.47pg/ml vs44.47±4.15pg/ml,P值分別小于0.01和0.001),此外IL-22+CS組CXCL9和CXCL10濃度顯著高于CS組(P值均小于0.05)；IL-8(77.05±4.14pg/ml和92.41±5.22pg/ml vs58.39±7.79pg/ml,P值均小于0.001),其中IL-22+CS組IL-8還顯著高于CS組(P0.001)；TGF-β1(173.63±4.53pg/ml和187.29±3.38pg/ml vs127.06±5.32pg/ml,P值均小于0.001),IL-22+CS組TGF-β1還顯著高于CS組(P0.01)：IL-6(109.78±6.96pg/ml和112.91±9.67pg/ml vs87.74±6.96pg/ml,P值均小于0.001)；TNF-a (407.83±20.69pg/ml和423.54±43.74pg/ml vs343.78±25.95pg/ml,P值分別小于0.05和0.01),而TNF-α在這兩組間差異無統(tǒng)計學意義(F0.05); IL-22(91.52±5.09pg/ml和95.45±3.75pg/ml vs74.53±0.73pg/ml,P值均小于0.001),IL-22+CS組IL-22還明顯高于CS組(P0.05)。 第二部戒煙后小鼠肺部炎癥的變化及CXCR3配體在其中所起的作用 1.肺功能CS組和SC組與正常對照組比較,Rn顯著增加(0.67±0.08cmH2O.s/ml和0.65±0.12cmH2O.s/ml vs0.52±0.03cmH2O.s/ml,P值分別小于0.01和0.05)；而G和H則顯著降低(G:7.60±0.64cmH2O/ml和6.09±0.99cmH2O/m vs9.31±1.89cmH2O/ml,P值分別小于0.05和0.001；H:32.10±2.59cmH2O/ml和25.59±5.17cmH2O/ml vs46.20±8.11cmH2O/ml,P值均小于0.001)。SC組與CS組比較, G、H及Rn均有降低,其中G和H在兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P值均小于0.05),而Rn在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.肺組織病理學評分結果光鏡下可見CS組和SC組出現(xiàn)上皮損傷、小氣道壁及肺實質炎細胞浸潤、鱗狀上皮化生以及膠原蛋白沉積等。根據(jù)病理評分標準,CS組和SC組與正常對照組比較,病理總評分顯著增高(4.83±1.47和4.17±0.75vs1.33±0.52,P值均小于0.001),而病理總評分在這兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3. BALF炎癥細胞總數(shù)及分類香煙暴露后,CS組炎癥細胞總數(shù)顯著高于正常對照組(16.75±0.88*104/ml vs6.25±0.97*104/ml, P0.001)。戒煙后SC組炎癥細胞總數(shù)顯著低于CS組(11.54±0.68*104/ml vs16.75±0.88*104/ml, P0.001),但與正常對照組比較,SC組炎癥細胞總數(shù)顯著增加(P0.001)。在增加的炎癥細胞中,以巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞為主。 4.肺組織趨化因子或細胞因子mRNA表達水平CS組和SC組與正常對照組比較,以下趨化因子mRNA表達水平顯著升高：CXCL9(P值分別小于0.01和0.001);CXCL10(P值分別小于0.05和0.001),此外SC組CXCL9和CXCL10mRNA表達水平顯著高于CS組(P值分別小于0.05和0.01)。CS組和SC組與正常對照組比較,以下MMPs mRNA表達水平顯著升高：MMP9(P分別小于0.001及0.05)；MMP12(P分別小于0.01及0.001)；而MMP2mRNA僅在CS組顯著升高(P0.05),此外SC組MMP12mRNA表達顯著高于SC組(P0.001)。TGF-β1mRNA表達水平僅在CS組顯著高于正常對照組(P0.01)。 5.肺組織趨化因子或細胞因子蛋白表達水平與正常對照組相比較,CS組和SC組在以下趨化因子或細胞因子蛋白表達顯著升高：CXCL9(3.17±0.41和2.67±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；CXCL10(2.17±0.41和2.00±0.63vs1.17±0.41,P值分別小于0.01和0.05)；CXCL11(3.17±0.41和2.83±0.41vs1.50±0.55,P值均小于0.001)；TGF-β1(2.67±0.52和2.17±0.75vs1.17±0.41,P值分別小于0.001和0.01)；MMP2(3.17±0.41和2.33±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；MMP9(3.17±0.41和2.50±0.55vs1.50±0.55,P值分別小于0.001及0.01)；MMP12(2.83±0.41和2.67±0.52vs1.17±0.41,P0.001),其中CS組MMP2和MMP9表達顯著高于SC組(P值分別小于0.01和0.05),余差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6. BALF上清趨化因子或細胞因子濃度CS組和SC組與正常對照組比較,以下細胞因子或趨化因子濃度顯著增加：CXCL9(75.13±8.63pg/ml和79.45±8.72pg/ml vs66.33±5.40pg/ml,P值分別小于0.05和0.01)；CXCL10(143.86±5.43pg/ml和132.99±6.65pg/ml vs104.15±4.86pg/ml,P值均小于0.001)；CXCL11(53.67±5.26pg/ml和53.82±7.34pg/ml vs44.47±4.15pg/ml,P值均小于0.01),其中CS組CXCL10的濃度顯著高于SC組(P0.01)；IL-8(77.05±4.14pg/ml和77.48±6.64pg/ml vs58.38±7.79pg/ml,P值均小于0.001)；TGF-β1(173.63±4.53pg/ml和161.21±8.68pg/ml vs127.06±5.32pg/ml,P值均小于0.001)；與正常對照組比較,以下細胞因子濃度僅在CS組中顯著增加：IL-6(109.78±6.96pg/ml vs87.74±6.96pg/ml, P0.001); TNF-a (407.83±20.69pg/ml vs343.78±25.95pg/ml, P0.05). 結論 第一部IL-22對香煙誘導小鼠肺部炎癥的作用及機制IL-22加重香煙暴露小鼠肺部炎癥,可能與CXCR3配體、IL-17A等炎癥相關趨化因子或細胞因子的存在有關。 第二部戒煙后小鼠肺部炎癥的變化及CXCR3配體在其中所起的作用香煙暴露引起炎癥細胞在肺組織中聚集以及炎癥細胞因子升高,戒煙后,炎癥細胞及細胞因子盡管有所下降,但仍顯著高于正常對照組。戒煙后肺部炎癥持續(xù)存在,CXCR3配體可能在其中起到關鍵作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.1
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本文編號：1564081