本文選題：香煙煙霧　切入點(diǎn)：戒煙　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景及目的 白介素-22(IL-22)屬于白介素-10(IL-10)細(xì)胞因子家族成員,同時(shí)具有促進(jìn)炎癥及抗炎雙重性質(zhì),各種不同因素的作用下,IL-22發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng),包括IL-22在局部濃度水平、作用時(shí)間的長(zhǎng)短以及其所發(fā)揮作用的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)環(huán)境等。香煙暴露(CS)是多種氣道疾病發(fā)生和發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素,而且,即使戒煙后,這種影響仍繼續(xù)延續(xù),即氣道炎癥仍然存在。盡管有關(guān)IL-22在呼吸系統(tǒng)疾病中的研究不少,如在博裂霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中表現(xiàn)出保護(hù)作用。然而,IL-22在CS誘導(dǎo)的肺部炎癥中的機(jī)制尚不清楚。因此,本研究擬通過(guò)CS誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥模型,給予IL-22干預(yù),研究IL-22干預(yù)對(duì)香煙誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥的作用及機(jī)制。同時(shí)擬通過(guò)戒煙小鼠動(dòng)物模型,觀察戒煙后小鼠肺部炎癥以及相關(guān)趨化因子及細(xì)胞因子的變化并探討其機(jī)制。 方法 1.雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control).香煙暴露組(CS). IL-22組(IL-22)、IL-22+香煙暴露組(IL-22+CS)及戒煙組(SC),每組各6只。(1)CS組小鼠每天置于艙內(nèi),香煙暴露前半小時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水,每次5支香煙,每天4次,兩次間隔30分鐘,連續(xù)暴露3天；(2)正常對(duì)照組小鼠暴露于過(guò)濾空氣,除香煙暴露外,其他條件同CS組；(3)IL-22組小鼠暴露于過(guò)濾空氣,腹腔注射rhIL-22(按100μg/kg體重劑量),除香煙暴露外,其他條件同正常對(duì)照組；(4)IL-22+CS組小鼠除香煙暴露前半小時(shí)腹腔注射rhIL-22(按100μg/kg體重劑量)外,其他條件同CS組；(5)SC組小鼠前3天條件同CS組,第4天起暴露于過(guò)濾空氣,1周后處死小鼠。 2.采用Flexivent小鼠肺功能儀,測(cè)量小鼠組織衰減(G)、組織彈性(H)及氣道阻力(Rn)。 3.通過(guò)HE及Masson染色觀察肺部形態(tài)、炎癥及氣道周?chē)z原蛋白沉積情況,并進(jìn)行病理評(píng)分。 4.使用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞總數(shù)以及通過(guò)細(xì)胞甩片HE染色進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)。 5.采用Real-Time PCR方法及免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠肺組織中趨化因子CXC基序受體3CCXCR3)配體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、白介素-17A(IL-17A)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1) mRNA及蛋白表達(dá)水平。 6.應(yīng)用ELISA法測(cè)量BALF上清中CXCR3配體、IL-22、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-a)及TGF-β1濃度。 結(jié)果 第一部1L-22對(duì)香煙誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥的作用及機(jī)制 1.肺功能CS組、IL-22組及IL-22+CS與正常對(duì)照組比較,Rn顯著增加(0.67±0.08cmH2O.s/ml、0.68±0.08cmH2O.s/ml及0.78±0.10cmH2O.s/ml vs0.52±0.03cmH2O.s/ml,P值分別小于0.01、0.01及0.001)；而G和H則顯著降低(G:7.60±0.64cmH2O/ml、6.78±0.89cmH2O/ml及5.59±0.57cmH2O/ml vs9.31±1.89cmH20/ml,P值分別小于0.05、0.01及0.001；H:32.10±2.59cmH2O/ml,28.52±2.22cmH2O/ml及25.66±2.54cmH2O/ml vs46.20±8.11cmH20/ml,P值均小于0.001)。IL-22+CS組與CS組比較,Rn顯著升高(P0.05),而G和H則顯著降低(P值分別小于0.01和0.05)。 2.肺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果光鏡下可見(jiàn)CS組和IL-22+CS組出現(xiàn)上皮損傷、小氣道壁及肺實(shí)質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、鱗狀上皮化生以及膠原蛋白沉積等。根據(jù)病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),CS組、IL-22組及IL-22+CS組與正常對(duì)照組比較,病理總評(píng)分均顯著增高(4.83±1.47、2.67±±0.52及7.00±0.89vs1.33±0.52,P值分別小于0.001、0.05及0.001), IL-22+CS組與CS組比較,病理總評(píng)分亦顯著增加(P0.01)。 3. BALF炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)CS組、IL-22組及IL-22+CS組的炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(16.75±0.88*104/ml、13.08±0.82*104/ml及22.04±1.34*104/ml vs6.25±0.97*104/ml,P值均小于0.001)。IL-22+CS組炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著高于CS組比較(P0.001)。在增加的炎癥細(xì)胞中,以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主。 4.肺組織趨化因子或細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平CS組、IL-22組及IL-22+CS組較正常對(duì)照組,以下趨化因子mRNA表達(dá)水平顯著升高：CXCL9(P值分別小于0.01、0.001及0.01)；CXCL10(P值分別小于0.05、0.05及0.001);而CXCL11僅在IL-22+CS組顯著升高(P0.01),余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),此外IL-22+CS組CXCL10和CXCL11mRNA表達(dá)水平顯著高于CS組(P值均小于0.01)。TGF-β1和IL-17A mRNA表達(dá)水平僅在CS組和IL-22+CS組顯著高于正常對(duì)照組(TGF-β1:P值分別小于0.01和0.001；IL-17A:P值均小于0.001),其中IL-22+CS組TGF-β1mRNA表達(dá)水平顯著高于CS組(P0.05)。 5.肺組織趨化因子或細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比較,CS組和IL-22+CS組在以下趨化因子或細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平顯著升高：CXCL9(3.17±0.41和3.50±±0.55vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；CXCL10(2.17±0.41和2.83±0.75vs1.17±0.41,P值分別小于0.01和0.001); CXCL11(3.17±0.41和3.17±0.41vs1.50±0.55,P值均小于0.001),此外IL-22+CS組CXCL10蛋白表達(dá)水平顯著高于CS組(P0.05)；TGF-β1(2.67±0.52和3.67±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001),其中IL-22+CS組TGF-β1顯著高于CS組(P0.01); IL-17A(3.17±0.41和3.33±0.52vs1.67±0.52,P值均小于0.001),而IL-17A在這兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6. BALF趨化因子或細(xì)胞因子濃度CS組和IL-22+CS組與正常對(duì)照組比較,以下細(xì)胞因子或趨化因子濃度顯著增加：CXCL9(75.13±8.63pg/ml和85.04±8.32pg/ml vs66.33±5.40pg/ml,P值分別小于0.05和0.001)；CXCL10(143.86±5.43pg/ml和152.90±9.34pg/ml vs104.15±4.86pg/ml,P值均小于0.001); CXCL11(53.67±5.26pg/ml和56.34±3.47pg/ml vs44.47±4.15pg/ml,P值分別小于0.01和0.001),此外IL-22+CS組CXCL9和CXCL10濃度顯著高于CS組(P值均小于0.05)；IL-8(77.05±4.14pg/ml和92.41±5.22pg/ml vs58.39±7.79pg/ml,P值均小于0.001),其中IL-22+CS組IL-8還顯著高于CS組(P0.001)；TGF-β1(173.63±4.53pg/ml和187.29±3.38pg/ml vs127.06±5.32pg/ml,P值均小于0.001),IL-22+CS組TGF-β1還顯著高于CS組(P0.01)：IL-6(109.78±6.96pg/ml和112.91±9.67pg/ml vs87.74±6.96pg/ml,P值均小于0.001)；TNF-a (407.83±20.69pg/ml和423.54±43.74pg/ml vs343.78±25.95pg/ml,P值分別小于0.05和0.01),而TNF-α在這兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F0.05); IL-22(91.52±5.09pg/ml和95.45±3.75pg/ml vs74.53±0.73pg/ml,P值均小于0.001),IL-22+CS組IL-22還明顯高于CS組(P0.05)。 第二部戒煙后小鼠肺部炎癥的變化及CXCR3配體在其中所起的作用 1.肺功能CS組和SC組與正常對(duì)照組比較,Rn顯著增加(0.67±0.08cmH2O.s/ml和0.65±0.12cmH2O.s/ml vs0.52±0.03cmH2O.s/ml,P值分別小于0.01和0.05)；而G和H則顯著降低(G:7.60±0.64cmH2O/ml和6.09±0.99cmH2O/m vs9.31±1.89cmH2O/ml,P值分別小于0.05和0.001；H:32.10±2.59cmH2O/ml和25.59±5.17cmH2O/ml vs46.20±8.11cmH2O/ml,P值均小于0.001)。SC組與CS組比較, G、H及Rn均有降低,其中G和H在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小于0.05),而Rn在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.肺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果光鏡下可見(jiàn)CS組和SC組出現(xiàn)上皮損傷、小氣道壁及肺實(shí)質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、鱗狀上皮化生以及膠原蛋白沉積等。根據(jù)病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),CS組和SC組與正常對(duì)照組比較,病理總評(píng)分顯著增高(4.83±1.47和4.17±0.75vs1.33±0.52,P值均小于0.001),而病理總評(píng)分在這兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3. BALF炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)香煙暴露后,CS組炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(16.75±0.88*104/ml vs6.25±0.97*104/ml, P0.001)。戒煙后SC組炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著低于CS組(11.54±0.68*104/ml vs16.75±0.88*104/ml, P0.001),但與正常對(duì)照組比較,SC組炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著增加(P0.001)。在增加的炎癥細(xì)胞中,以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主。 4.肺組織趨化因子或細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平CS組和SC組與正常對(duì)照組比較,以下趨化因子mRNA表達(dá)水平顯著升高：CXCL9(P值分別小于0.01和0.001);CXCL10(P值分別小于0.05和0.001),此外SC組CXCL9和CXCL10mRNA表達(dá)水平顯著高于CS組(P值分別小于0.05和0.01)。CS組和SC組與正常對(duì)照組比較,以下MMPs mRNA表達(dá)水平顯著升高：MMP9(P分別小于0.001及0.05)；MMP12(P分別小于0.01及0.001)；而MMP2mRNA僅在CS組顯著升高(P0.05),此外SC組MMP12mRNA表達(dá)顯著高于SC組(P0.001)。TGF-β1mRNA表達(dá)水平僅在CS組顯著高于正常對(duì)照組(P0.01)。 5.肺組織趨化因子或細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比較,CS組和SC組在以下趨化因子或細(xì)胞因子蛋白表達(dá)顯著升高：CXCL9(3.17±0.41和2.67±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；CXCL10(2.17±0.41和2.00±0.63vs1.17±0.41,P值分別小于0.01和0.05)；CXCL11(3.17±0.41和2.83±0.41vs1.50±0.55,P值均小于0.001)；TGF-β1(2.67±0.52和2.17±0.75vs1.17±0.41,P值分別小于0.001和0.01)；MMP2(3.17±0.41和2.33±0.52vs1.17±0.41,P值均小于0.001)；MMP9(3.17±0.41和2.50±0.55vs1.50±0.55,P值分別小于0.001及0.01)；MMP12(2.83±0.41和2.67±0.52vs1.17±0.41,P0.001),其中CS組MMP2和MMP9表達(dá)顯著高于SC組(P值分別小于0.01和0.05),余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6. BALF上清趨化因子或細(xì)胞因子濃度CS組和SC組與正常對(duì)照組比較,以下細(xì)胞因子或趨化因子濃度顯著增加：CXCL9(75.13±8.63pg/ml和79.45±8.72pg/ml vs66.33±5.40pg/ml,P值分別小于0.05和0.01)；CXCL10(143.86±5.43pg/ml和132.99±6.65pg/ml vs104.15±4.86pg/ml,P值均小于0.001)；CXCL11(53.67±5.26pg/ml和53.82±7.34pg/ml vs44.47±4.15pg/ml,P值均小于0.01),其中CS組CXCL10的濃度顯著高于SC組(P0.01)；IL-8(77.05±4.14pg/ml和77.48±6.64pg/ml vs58.38±7.79pg/ml,P值均小于0.001)；TGF-β1(173.63±4.53pg/ml和161.21±8.68pg/ml vs127.06±5.32pg/ml,P值均小于0.001)；與正常對(duì)照組比較,以下細(xì)胞因子濃度僅在CS組中顯著增加：IL-6(109.78±6.96pg/ml vs87.74±6.96pg/ml, P0.001); TNF-a (407.83±20.69pg/ml vs343.78±25.95pg/ml, P0.05). 結(jié)論 第一部IL-22對(duì)香煙誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥的作用及機(jī)制IL-22加重香煙暴露小鼠肺部炎癥,可能與CXCR3配體、IL-17A等炎癥相關(guān)趨化因子或細(xì)胞因子的存在有關(guān)。 第二部戒煙后小鼠肺部炎癥的變化及CXCR3配體在其中所起的作用香煙暴露引起炎癥細(xì)胞在肺組織中聚集以及炎癥細(xì)胞因子升高,戒煙后,炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子盡管有所下降,但仍顯著高于正常對(duì)照組。戒煙后肺部炎癥持續(xù)存在,CXCR3配體可能在其中起到關(guān)鍵作用。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R563.1
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本文編號(hào)：1564081