本文關(guān)鍵詞： 矽肺 松弛素 肺纖維化 巨噬細(xì)胞 成纖維細(xì)胞 Ⅰ型膠原 基質(zhì)金屬蛋白酶　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：矽肺是世界上流行最廣的職業(yè)病,也是我國危害最為嚴(yán)重的職業(yè)病之一。此病由長期大量吸入含游離二氧化硅的粉塵而引起,其后隨著炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡炎、成纖維細(xì)胞增生、矽結(jié)節(jié)形成,最終導(dǎo)致局部肺組織甚至是全肺纖維化。至今對矽肺纖維化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識仍有限,也未找到治愈的方案。 松弛素自1926年被發(fā)現(xiàn)以來,一直被認(rèn)為是一種可以重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)的激素,主要作用于雌性動物生殖道起到利于分娩的效果。最近的研究表明它不僅是一種生殖相關(guān)激素,而且可以穩(wěn)定締組織內(nèi)環(huán)境,在肺臟、心臟、腎臟、腦、皮膚組織等非生殖組織都起到了抗纖維化作用。采用人肺成纖維細(xì)胞的體外實驗結(jié)果表明,外源性松弛索可以通過抑制膠原蛋白分泌和/或沉積和刺激金屬基質(zhì)蛋白酶表達(dá)減少基質(zhì)的堆積,并抑制轉(zhuǎn)化生長因子誘導(dǎo)的膠原蛋白和/或纖維連接蛋白的分泌。動物試驗結(jié)果顯示,敲除松弛素及其受體基因的小鼠肺臟內(nèi)間質(zhì)蛋白持續(xù)增多。此外,松弛素還可抑制小鼠模型中由博來霉素所致的纖維化病變,而這種纖維化病變的病理學(xué)特征與矽塵所致肺纖維化有某些相似性。上述研究表明,松弛素可作為一種潛在的藥物用于抑制二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化,然而松弛索在石英塵致矽肺形成中的作用日前尚不清楚。 本研究建立矽肺體內(nèi)動物模型和體外細(xì)胞模型,并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用蘇木精-伊紅染色,堿水解法,實時熒光定量PCR法、免疫組織化學(xué)法、明膠酶譜法和酶聯(lián)免疫法等方法,觀察矽肺動物模型中內(nèi)源性松弛素的變化及外源性松弛素處理對矽肺體外細(xì)胞模型影響,以論證松弛素對肺纖維化的拮抗作用。本研究分為三部分： 第一部分大鼠矽肺形成過程中松弛素及其受體mRNA.蛋白表達(dá)及其細(xì)胞定位 目的：探討松弛索(松弛素)及其受體在大鼠矽肺形成過程中的潛在作用。 方法：將64只Wistar大鼠隨機(jī)分為2個實驗組,即對照組、矽肺組。氣管滴注二氧化硅(德國標(biāo)準(zhǔn)石英DQ12)粉塵懸液建立大鼠矽肺模型。模型建立后,分4個時間點(diǎn)(1d、7d、14d、28d),每組每個時間點(diǎn)分別取8只大鼠將其處死。以蘇木精-伊紅染色觀察矽肺動物模型的病理變化,以堿水解法檢測羥脯氨酸含量,實時熒光定量PCR法、免疫組織化學(xué)法分別檢測矽肺形成過程中松弛素及其受體RXFP1等細(xì)胞因子基因和蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果： (1)大鼠肺組織羥脯氨酸含量 第1、7、14天時大鼠矽肺組和對照組羥脯氨酸含量沒有明顯差別,第28天時矽肺組羥脯氨酸含量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 (2)大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變 對照組大鼠肺組織正常無損,實驗組大鼠在染塵1至7天表現(xiàn)為急性炎癥改變,第28天成纖維細(xì)胞增生加劇,纖維組織成條索狀,可見纖維小結(jié)。 (3)實時熒光定量PCR實驗結(jié)果 熒光實時定量PCR結(jié)果顯示矽肺組和對照組大鼠的肺組織在所有時間點(diǎn)均有Rlnl和Rxfpl mRNA表達(dá)。矽肺組在第7天時Rlnl顯著高于至對照組(P0.05),第28天時降低至對照組水平以下(P0.05)。矽肺組在第1天時RxfplmRNA表達(dá)高于對照(P0.05),第7天時減弱至對照組水平,第28天降低至對照組以下(P0.05)。 (4)免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果 矽肺組肺松弛素蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,主要定位于Ⅰ型肺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；與對照組相比,染石英塵后第7天松弛素蛋白水平明顯增高(P0.05),第28天時則明顯減少(P0.05)。染石英塵后第1天RXFP1蛋白水平明顯增高(P0.05),第28天時明顯減少(P0.05)。主要定位于巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。 結(jié)論：羥脯氨酸含量變化和HE染色結(jié)果顯示大鼠矽肺模型構(gòu)建成功。在該模型中,矽肺形成時大鼠肺組織中內(nèi)源性松弛素及其受體RXFP1的表達(dá)隨矽肺進(jìn)程變化明顯,主要定位于肺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,提示矽肺形成過程中松弛索很可能通過上述細(xì)胞起作用。 第二部分松弛素對DQ12染毒THP-1纖維化細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響 目的：在第一部分研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討矽肺發(fā)生過程中松弛素可能的來源,及其在炎癥反應(yīng)期的作用。 方法：本部分以佛波酯(PMA)刺激分化THP-1,其后將細(xì)胞分四組處理：MEM對照組、DQ12(200μg/ml)單獨(dú)染毒組、松弛素(10ng/ml)單獨(dú)染毒組、DQ12 (200μg/ml)和松弛素(10ng/ml)聯(lián)合染毒組,分別在1、3、6、12、24h以實時熒光定量PCR法檢測RLN2、RXFP1、TGFB1等基因mRNA變化。 結(jié)果： (1)PMA誘導(dǎo)分化結(jié)果 以10ng/ml刺激THP-1 48h,90%以上的THP-1細(xì)胞開始貼壁,細(xì)胞形態(tài)為梭形,具有臣噬細(xì)胞的形態(tài)特征。 (2) RLN2 mRNA實驗結(jié)果 與對照組相比,DQ12單獨(dú)染毒3h及24h時THP-1細(xì)胞RLN2mRNA表達(dá)顯著增高(P0.05),外源性松弛素單獨(dú)染毒24h時THP-1細(xì)胞RLN2mRNA的表達(dá)顯著降低(P0.05)。與DQ12單獨(dú)染毒組相比,DQ12和松弛素聯(lián)合染毒3h及24h時RLN2 mRNA表達(dá)顯著下降(P0.05)。 (3) RXFPl mRNA實驗結(jié)果 與對照組相比,DQ12單獨(dú)染毒24h后THP-1細(xì)胞RXFP1mRNA表達(dá)顯著增高(P0.05),外源性松弛素單獨(dú)染毒1h時THP-1細(xì)胞RXFP1 mRNA表達(dá)顯著增高,染毒24h時則顯著降低(P0.05)。 (4) TGFB1 mRNA實驗結(jié)果 與對照組相比,DQ12單獨(dú)染毒12h后THP-1細(xì)胞TGFB1基因mRNA表達(dá)顯著增高(P0.05)。與DQ12單獨(dú)染毒組相比,DQ12和松弛素聯(lián)合染毒3h時THP-1細(xì)胞TGFB1基因mRNA表達(dá)顯著降低(P0.05)。 結(jié)論：DQ12可誘導(dǎo)THP-1中松弛素及其受體RXFP1的表達(dá),而外源性松弛素可明顯弱化這種效應(yīng),提示矽肺發(fā)生過程中巨噬細(xì)胞是內(nèi)源性松弛素的來源之一。 第三部分松弛素對MRC-5成纖維細(xì)胞功能的影響 目的：以THP-1和MRC-5細(xì)胞構(gòu)建矽肺體外細(xì)胞模型,以深入研究外源性松弛素的抗纖維化機(jī)制。 方法：即先用佛波酯誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞,再以DQ12染毒已分化的THP-1,12h后提取THP-1培養(yǎng)上清(THP-1 CS)。隨后將MRC-5細(xì)胞分四組處理：MEM對照組、THP-1 CS單獨(dú)染毒組、松弛素(1、10、100 ng/ml)單獨(dú)染毒組、THP-1 CS和松弛素(1、10、100 ng/m1)聯(lián)合染毒組,染毒48h后檢測檢測MRC-5細(xì)胞的增殖,以實時熒光定量PCR法、明膠酶譜法和酶聯(lián)免疫法檢測MRC-5細(xì)胞MMP-2的表達(dá)和活性、膠原的合成和分泌。 結(jié)果： (1)細(xì)胞增殖結(jié)果 與對照組相比,THP-1 CS可明顯增強(qiáng)MRC-5的增殖(P0.05)；與THP-1CS單獨(dú)染毒組相比,THP-1 CS和松弛素聯(lián)合染毒能顯著降低MRC-5的增殖(P0.05)。松弛素單獨(dú)處理對細(xì)胞增殖的作用不明顯。 (2)實時熒光定量PCR實驗結(jié)果 與對照組相比,THP-1 CS可明顯增強(qiáng)MRC-5細(xì)胞COL 1A1的表達(dá)(P0.05)。與THP-1 CS單獨(dú)染毒組相比,THP-1 CS和松弛素聯(lián)合染毒組COL 1A1的表達(dá)顯著降低(P0.05)。此外,松弛素單獨(dú)染毒組MRC-5細(xì)胞MMP2的表達(dá)顯著高于對照組(P0.05)。與THP-1 CS單獨(dú)組相比,THP-1 CS和100 ng/ml松弛素聯(lián)合染毒組MMP2的表達(dá)顯著降低(P0.01) (3)明膠酶譜結(jié)果 與對照組相比,THP-1 CS可明顯增強(qiáng)MMP-2的活性(P0.05)。與THP-1CS單獨(dú)染毒組相比,THP-1 CS和松弛素聯(lián)合染毒MMP-2的活性顯著增強(qiáng)(P0.01)。 (4)酶聯(lián)吸附實驗結(jié)果 與對照組相比,THP-1 CS可明顯增加MRC-5上清中Ⅰ型膠原含量(P0.05)。與THP-1 CS單獨(dú)染毒組相比,THP-1 CS和松弛素聯(lián)合染毒組Ⅰ型膠原含量顯著減少(P0.01)。 結(jié)論：本部分研究結(jié)果提示松弛素可能通過如下方式影響矽塵誘導(dǎo)的、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的肺纖維化：1)抑制細(xì)胞增殖,2)抑制膠原合成,3)誘導(dǎo)MMP-2活性。這些結(jié)果表明松弛素具有治療矽肺的潛力。
[Abstract]:Silicosis is the world's most widely popular occupation disease harm, China is one of the most serious disease. The occupation by a large number of long-term inhalation of dust containing free silica caused subsequently with inflammatory cell infiltration, alveolar inflammation, fibroblast proliferation, silicotic nodule formation, leading to local lung tissue and even whole lung since the understanding of the pathogenesis of fibrosis. Pulmonary fibrosis is still limited, also did not find a cure.
Relaxin was found since 1926, has been considered as a hormone can reconstruct the extracellular matrix, a major role in the female reproductive tract from the animal to facilitate parturition. Recent studies have shown that it is not only a kind of reproductive hormones, and can stabilize the connective tissue environment in the lung, heart, kidney. The brain, skin and other non reproductive tissues play an anti fibrotic effect. Using human lung fibroblasts in vitro results showed that exogenous slack cable can inhibit the secretion of collagen and / or deposition and stimulation of metal matrix protease decreased expression of matrix accumulation, and inhibit the secretion of transforming growth factor induced collagen and and / or fibronectin. Animal experiments showed that the knockout mice lung interstitial relaxin receptor gene and its protein continued to increase. In addition, relaxin can inhibit mouse model Naka Yuhiro to streptozotocin induced fibrosis, and the pathological characteristics of hepatic fibrosis have some similarities with silica induced pulmonary fibrosis. These studies show that relaxin can be used as a potential drug for inhibition of silica induced pulmonary fibrosis, however, relaxation cable in quartz dust in the role of the day before is not clear.
This study established the animal model of silicosis in vivo and in vitro cell model, and then using hematoxylin eosin staining, alkaline hydrolysis method, real-time fluorescence quantitative PCR, immunohistochemistry, zymography and ELISA method, observe the animal model of silicosis in endogenous and exogenous relaxin changes relaxin treatment effect on silicosis in vitro cell model, in order to demonstrate the antagonistic effects of relaxin on pulmonary fibrosis. This study is divided into three parts:
The expression of relaxin and its receptor mRNA. protein and its cell location during the formation of silicosis in the first part of rats
Objective: To explore the potential role of relaxin and its receptor in the formation of silicosis in rats.
Methods: 64 Wistar rats were randomly divided into 2 experimental groups, namely control group, Silicosis group. Intratracheal instillation of silica (German standard quartz DQ12) dust suspension model of Silicosis Rats. After model establishment, 4 time points (1D, 7d, 14d, 28d), each time respectively 8 rats were killed. The animal model of silicosis pathological changes were observed by hematoxylin eosin staining, to detect the content of hydroxyproline alkaline hydrolysis method, real-time fluorescence quantitative PCR method was used to detect the expression of relaxin receptor RXFP1 and cytokine gene and protein level in the process of the formation of silicosis by immunohistochemical method.
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本文編號：1519585