本文關(guān)鍵詞： 急性百草枯中毒 肺纖維化 TGF-α_1 E-cadhern α-SMA　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[研究背景]"肺纖維化"是"彌漫性間質(zhì)性肺疾病(間質(zhì)性肺疾病)的簡(jiǎn)稱,是一組慢性進(jìn)行性破壞性肺間質(zhì)疾病。病理特征:肺泡壁呈慢性炎癥和與肺間質(zhì)纖維化改變。其中臨床最常見為特發(fā)性肺纖維化患者,占所有肺纖維化的65%。影像學(xué)表現(xiàn):胸膜下肺組織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),或出現(xiàn)蜂窩狀改變,雙下肺表現(xiàn)明顯,可出現(xiàn)磨玻璃影改變[1]。關(guān)于肺纖維化的發(fā)病機(jī)制,目前尚未完全闡明。既往有研究表明肺損傷后在肺泡上皮修復(fù)的過程中,出現(xiàn)了肺間質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖及活化,導(dǎo)致成纖維細(xì)胞灶的形成,引起細(xì)胞外基質(zhì)大量分泌并蓄積引起肺間質(zhì)增寬,以上過程為不可逆性破壞[2]。肺纖維化作為呼吸系統(tǒng)四大病種之一,病因多種多樣,比如物理因素、感染性因素、血管性因素等。在臨床工作中,隨著農(nóng)藥百草枯的廣泛使用,百草枯中毒在臨床急癥中頻發(fā),百草枯中毒導(dǎo)致肺纖維化患者逐漸增加。百草枯(PQ),目前應(yīng)用最廣的有機(jī)雜環(huán)類除草劑,商品名為克無蹤,化學(xué)成分為1,1'-二甲基-4,4'-聯(lián)吡啶二氯化物。臨床中口服百草枯后經(jīng)胃腸道吸收率為5-15%,百草枯吸收后可分布于全身組織器官,由于肺泡上皮細(xì)胞的主動(dòng)攝取功能,故肺組織中濃度最高,肺組織濃度可達(dá)到血液組織濃度的10-90倍,中毒患者1周內(nèi)主要表現(xiàn)以急性肺水腫為主,1周后可出現(xiàn)肺纖維化改變,并且逐漸加重,2-3周達(dá)到高峰,形成明顯纖維化。肺臟作為百草枯中毒的主要靶器官,是目前百草枯中毒死亡的主要原因。大量中毒患者多死于早期肺損傷所導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS),晚期死亡原因多為百草枯中毒引起的肺纖維化[3]。急性百草枯中毒(acute paraquat poisoning,APP)導(dǎo)致肺纖維化既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):急性百草枯中毒后百草枯于肺泡上皮細(xì)胞大量蓄積,引起肺泡上皮細(xì)胞損傷與間質(zhì)細(xì)胞增生,成為目前急性百草枯中毒肺纖維化研究熱點(diǎn)。以上發(fā)生過程中出現(xiàn)成上皮細(xì)胞數(shù)量降低,形態(tài)改變,纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯增加,從而引起肺組織纖維化發(fā)生[1]。細(xì)胞因子(CK)網(wǎng)絡(luò)失衡學(xué)說在急性百草枯中毒發(fā)病機(jī)制中起重要作用,在眾多細(xì)胞因子中,TGF-β1公認(rèn)為始動(dòng)因子。研究發(fā)現(xiàn),以百草枯刺激A549細(xì)胞,可觀察到百草枯上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化,以及TGF-β1含量明顯增高,證實(shí)TGF-β1可能是百草枯誘導(dǎo)肺纖維化過程中的關(guān)鍵因子[5]。在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中,上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白與間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白表達(dá)的含量變化[6-9],可作為證實(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要依據(jù)。本研究的第一部分:跟蹤急性百草枯中毒患者雙肺CT變化,篩選肺纖維化患者為研究對(duì)象,按時(shí)間點(diǎn)留取血液標(biāo)本,檢測(cè)百草枯中毒患者血清中炎性因子TGF-β1的含量變化,分析肺纖維化與炎性因子變化的相關(guān)性。第二部分:選擇A549細(xì)胞作為研究對(duì)象,通過TGF-β1、百草枯分別刺激A549細(xì)胞制造EMT的細(xì)胞模型,討論TGF-β1與百草枯導(dǎo)致肺纖維化機(jī)制。第三部分:選擇小鼠為研究對(duì)象,通過給予小鼠鼻飼百草枯建立肺纖維化動(dòng)物模型,從組織學(xué)及蛋白表達(dá)分子水平檢測(cè)TGF-β1在肺纖維化發(fā)病中的表達(dá)變化來預(yù)測(cè)可能的肺纖維化機(jī)制。目前為止,急性百草枯中毒仍無有效的治療方法,臨床死亡率居高不下,造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,探索急性百草枯中毒機(jī)制,明確治療靶點(diǎn),將為百草枯中毒臨床治療指引方向。[實(shí)驗(yàn)方法與研究?jī)?nèi)容]第一部分:急性百草枯中毒患者血液中炎癥指標(biāo)變化。選取2015.01-2016.01因急性百草枯中毒就診于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院患者,服藥24小時(shí)內(nèi),年齡18歲-60歲,每7天復(fù)查雙肺CT 了解肺部影像學(xué)進(jìn)展情況,檢測(cè)3小時(shí)、51小時(shí)、147小時(shí)內(nèi)血漿中E-cadhern、a-SMA、TGF-β,濃度變化。第二部分:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究百草枯與TGF-β1導(dǎo)致肺纖維化的作用及分子機(jī)制。共設(shè)置四個(gè)實(shí)驗(yàn)組:空白對(duì)照組、百草枯處理組、TGF-β1誘導(dǎo)組、百草枯+TGF-β1阻斷組。外源性TGF-β,組、百草枯溶液組、百草枯+TGF-β1阻斷劑組,分別刺激A549細(xì)胞,觀察A549細(xì)胞形態(tài)變化,免疫熒光與Western Blotting檢測(cè)顯示細(xì)胞表面上皮標(biāo)志性蛋E-Cadherin與間質(zhì)標(biāo)志性蛋白a-SMA表達(dá)情況。第三部分:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究TGF-α 1在百草枯中毒導(dǎo)致小鼠肺纖維化發(fā)病中的作用及機(jī)制。60只雄性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組(P組)、生理鹽水對(duì)照組(N組)。P組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均給予百草枯80mg/kg,用生理鹽水稀釋至lml后一次性灌胃染毒。N組采用生理鹽水80mg/kg灌胃,實(shí)驗(yàn)日期以動(dòng)物灌胃造模試驗(yàn)當(dāng)天為實(shí)驗(yàn)0天,實(shí)驗(yàn)第1天、3天、7天、14天、21天分別處死6只動(dòng)物,血漿行ELISA檢查檢測(cè)E-cadhern、a-SMA、TGF-β1水平,HE染色觀察肺組織形態(tài)變化,電鏡觀察上皮細(xì)胞形態(tài)變化及膠原沉積現(xiàn)象,選取TGF-β1、上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(E-cadherin)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白(a-SMA)作為檢測(cè)對(duì)象行免疫組化檢查。結(jié)果顯示:隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng),與N組比較,P組TGF-β,表達(dá)增高,證實(shí)TGF-β 1在肺纖維化早期起促進(jìn)肺纖維化發(fā)展的作用。組織學(xué)檢查證實(shí)急性百草枯中毒后肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)改變,表達(dá)下降,間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上升,膠原蛋白沉積,證實(shí)肺纖維化模型成功。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1.急性百草枯中毒患者肺部影像學(xué)改變與血漿中TGF-β1、E-cadhern、a-SMA含量。研究表明急性百草枯中毒致肺纖維化患者與對(duì)照組比較,中毒3小時(shí)TGF-β1含量無明顯變化,51小時(shí)、147小時(shí)血漿中TGF-β1含量明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在中毒早期TGF-β 1含量逐漸增高與雙肺CT肺纖維化進(jìn)程一致,說明TGF-β 1可能參與并促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)程。急性百草枯中毒患者血漿中E-Cadherin含量于3小時(shí)、51小時(shí)與對(duì)照組比較無明顯降低,第147小時(shí)比較明顯降低,說明隨著時(shí)間延長(zhǎng),上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)降低。與此相反,a-平滑肌肌動(dòng)蛋白含量于第3小時(shí)比較無明顯變化,51小時(shí)、147小時(shí)比較明顯增高,說明隨著時(shí)間延長(zhǎng),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白逐漸增多。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究百草枯與TGF-β 1導(dǎo)致肺纖維化的作用及分子機(jī)制。研究表明在A549細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入TGF-β,,百草枯,百草枯+TGF-β1阻斷劑。TGF-β,組可見A549細(xì)胞形態(tài)變化,由立方形或三角形轉(zhuǎn)變成長(zhǎng)梭形,細(xì)胞呈索條狀松散分布,即細(xì)胞發(fā)生了 EMT現(xiàn)象;百草枯組細(xì)胞同樣發(fā)生了 EMT現(xiàn)象,但細(xì)胞形態(tài)變化不如TGF-β1誘導(dǎo)組顯著。百草枯+TGF-β1阻斷組細(xì)胞形態(tài)改變較百草枯組減輕。免疫熒光與Western Blotting檢測(cè):TGF-β1、百草枯組E-Cadherin表達(dá)減少,a-SMA表達(dá)增加,百草枯+TGF-β 1阻斷組變化較前兩組減輕。以上結(jié)果說明TGF-β,作為肺纖維化的始動(dòng)因子可啟動(dòng)肺纖維化進(jìn)程,百草枯可能通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1從而發(fā)生肺纖維化,TGF-β 1阻斷組可抑制百草枯導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)展。3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究TGF-β1在百草中毒導(dǎo)致誘導(dǎo)小鼠肺纖維化發(fā)病中的作用及機(jī)制。(1)研究表明急性百草枯中毒小鼠血漿中TGF-β1含量于第1、3、7、14天明顯增高,21天比較無意義。急性百草枯小鼠患者血漿中E-Cadherin含量于第14、21天時(shí)與對(duì)照組比較明顯降低,說明隨著時(shí)間延長(zhǎng),上皮細(xì)胞表達(dá)降低。a-平滑肌肌動(dòng)蛋白含量于第7、14、21天比較明顯增高,說明隨著時(shí)間延長(zhǎng),間質(zhì)細(xì)胞逐漸增多。(2)HE染色表現(xiàn)急性百草枯中毒小鼠肺泡間隔破壞,增寬,肺泡內(nèi)見滲出物與血細(xì)胞。(3)電鏡觀察急性百草枯中毒小鼠肺泡上皮細(xì)胞破壞明顯,肺間質(zhì)明顯增寬,膠原表達(dá)增加。(4)急性百草枯中毒小鼠肺組織中羥脯胺酸含量較對(duì)照組明顯增高。(5)免疫組化顯示隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng)急性百草枯中毒小鼠肺組織中TGF-β,表達(dá)增高,E-Cadherin表達(dá)下降,a-SMA表達(dá)增高。[結(jié)論]通過急性百草枯中毒患者雙肺CT變化及給予小鼠百草枯灌胃造模證實(shí)急性百草枯中毒肺纖維化模型成立。急性百草枯中毒后可引起血漿及肺組織中E-Cadherin表達(dá)下降,a-SMA表達(dá)增多,肺組織中羥脯胺酸含量增加進(jìn)一步證實(shí)肺纖維化診斷。TGF-β1作為促炎因子,在肺纖維化的發(fā)病過程中起到始動(dòng)因子的作用。急性百草枯中毒后血漿及肺組織中TGF-β1表達(dá)增加,與肺纖維化進(jìn)展相關(guān);通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)百草枯通過刺激A549細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β 1可引起細(xì)胞EMT發(fā)生,TGF-β1阻斷組可抑制EMT的進(jìn)展。綜合以上結(jié)論證實(shí)百草枯通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TGF-β 1從而發(fā)生肺纖維化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R595.4;R563

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