本文關(guān)鍵詞：UFPs通過肺泡上皮細(xì)胞自噬紊亂誘導(dǎo)肺纖維化的機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展帶來了當(dāng)前的空氣污染問題,特別是反復(fù)出現(xiàn)的霧霾,引起了政府和公眾的關(guān)注。霧霾主要由大氣環(huán)境中存在的顆粒物(Particulate matter,PM)引起,特別是空氣動力學(xué)直徑(AD)2.5 gm的細(xì)顆粒物,一般稱為PM2.5。呼吸系統(tǒng)是顆粒物暴露的首要作用對象,流行病學(xué)研究顯示PM2.5與多種呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān),如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌等。一般認(rèn)為,顆粒物的毒性與顆粒物的直徑密切相關(guān),直徑越小,毒性越大,但當(dāng)前對超細(xì)顆粒物(AD≤0.1 μm, ultrafine particle, UFPs)的健康危害研究不夠全面與深入。需要指出的是,真實(shí)環(huán)境中的顆粒物樣本成分復(fù)雜,直徑分布不一,研究結(jié)果不易重復(fù)且難以分析。因此,實(shí)驗(yàn)室研究中常采用成分與直徑單一的人工合成顆粒物作為替代物。肺纖維化是慢性肺疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理改變,表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞持續(xù)性損傷、成纖維細(xì)胞過度增殖活化、尤其是膠原過度沉積,最終能引起呼吸衰竭。肺纖維化的機(jī)制尚未完全闡明,但認(rèn)為由多種機(jī)制共同調(diào)控。早期研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)肺纖維化的關(guān)鍵機(jī)制,細(xì)胞因子釋放、氧化應(yīng)激、成纖維細(xì)胞活化增殖在發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用；近期研究顯示,肺泡上皮細(xì)胞損傷同樣在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。已有動物實(shí)驗(yàn)報(bào)道表明UFPs經(jīng)肺灌注后,能夠誘導(dǎo)小鼠肺纖維化,但其發(fā)病機(jī)制的研究仍停留在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子等方面,UFPs是否可以通過直接損傷肺泡上皮細(xì)胞而誘導(dǎo)肺纖維化?尚無文獻(xiàn)報(bào)道。為探索UFPs對肺泡上皮細(xì)胞的作用及其在肺纖維化中的貢獻(xiàn),本學(xué)位論文擬以人工合成的納米級顆粒模擬大氣中的UFPs,研究該顆粒物誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷機(jī)制及其在小鼠肺纖維化中的作用。為此,本論文首先采用小鼠肺灌注模型模擬人體呼吸道顆粒物暴露過程,建立UFPs誘導(dǎo)肺纖維化模型。暴露1個(gè)月后,檢測小鼠肺功能并收集小鼠的肺組織進(jìn)行后續(xù)檢測。呼吸功能檢測結(jié)果顯示,UFPs暴露顯著降低小鼠肺順應(yīng)性；UFPs暴露后解剖小鼠,肉眼觀察可見肺部呈現(xiàn)彌散狀白色斑點(diǎn),且明顯增大,肺臟器系數(shù)顯著增加；Masson染色及天狼猩紅膠原染色表明,UFPs處理組小鼠膠原纖維的含量較對照組明顯增加；組織羥輔氨酸分析證明,UFPs處理增加小鼠肺組織中羥輔氨酸含量；qRT-PCR檢測CTGF基因的結(jié)果顯示,UFPs暴露上調(diào)其表達(dá)量；免疫組化結(jié)果表明,肺組織中α-SMA的表達(dá)量在UFPs處理之后顯著上調(diào)。以上結(jié)果充分證明,UFPs誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵殉晒�。進(jìn)一步,我們采用電鏡觀察UFPs在小鼠肺組織中的定位,結(jié)果顯示二型肺泡上皮細(xì)胞可以吞噬顆粒物,且肺組織凋亡增加。為了證明動物水平的結(jié)果是正確的,我們對體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行UFPs處理,同樣觀察到肺泡上皮細(xì)胞攝取UFPs,并發(fā)生凋亡。以上結(jié)果表明UFPs能夠靶向肺泡上皮細(xì)胞,提示肺泡上皮細(xì)胞損傷與UFPs誘導(dǎo)的肺纖維化相關(guān)。細(xì)胞自噬是真核生物中一種依賴溶酶體降解胞內(nèi)生物大分子和受損細(xì)胞器的過程,在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及應(yīng)對環(huán)境刺激中起重要作用,其紊亂已經(jīng)被證實(shí)參與了肺纖維化的多個(gè)過程。那么,自噬是否參與UFPs誘導(dǎo)的肺纖維化呢?為此,在本論文的小鼠肺纖維化模型中,我們利用免疫印跡與免疫組化技術(shù)檢測了自噬相關(guān)分子,結(jié)果顯示自噬的主要分子標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ在UFPs暴露的小鼠肺組織中顯著上調(diào),提示自噬可能參與了UFPs誘導(dǎo)的肺纖維化。為了詳細(xì)闡明UFPs影響細(xì)胞自噬的分子機(jī)制,我們在細(xì)胞水平開展深入研究。以A549細(xì)胞為研究對象,本論文證實(shí)UFPs確實(shí)可以引起肺泡上皮細(xì)胞自噬泡聚集。進(jìn)一步,我們?nèi)鏅z測了UFPs對自噬流的三個(gè)過程,即自噬泡生成、自噬溶酶體與自噬泡融合、自噬溶酶體降解的影響。結(jié)果顯示,UFPs不影響自噬調(diào)控蛋白mTOR的活性,說明經(jīng)典的mTOR信號通路并未參與UFPs誘發(fā)的自噬泡聚集過程；免疫印跡檢測表明,UFPs處理并不促進(jìn)自噬性降解底物蛋白p62的降解,反而增加細(xì)胞內(nèi)p62蛋白水平,提示自噬泡聚集源自于自噬性降解的抑制。一般認(rèn)為,自噬泡形成之后,需要與溶酶體融合形成自噬溶酶體,繼而在自噬溶酶體內(nèi)完成對底物的降解過程。我們的結(jié)果顯示,UFPs不影響自噬泡和溶酶體的融合,但能夠損傷溶酶體的降解能力。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),UFPs處理導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞的溶酶體腫脹,抑制溶酶體的正常酸化,從而抑制酸性水解酶(如組織蛋白酶D)的成熟。采用外加cAMP回復(fù)UFPs引起的溶酶體酸化抑制,可以加快細(xì)胞的自噬流降解,減少UFPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,UFPs可以上調(diào)A549細(xì)胞IL-1與IL-6的基因表達(dá)水平,而cAMP回復(fù)溶酶體酸化及rapamycin加快自噬流均能夠下調(diào)IL-1與IL-6的水平,說明超細(xì)顆粒物引起的自噬紊亂還可以調(diào)控炎癥反應(yīng)。現(xiàn)場采集的顆粒物樣本同樣能夠上調(diào)A549細(xì)胞中LC3,p62蛋白的表達(dá),表明自噬流阻斷在真實(shí)暴露中同樣存在。最后,本論文在動物體內(nèi)對細(xì)胞水平的研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。免疫印跡與免疫組化的結(jié)果表明,UFPs暴露上調(diào)小鼠肺組織中p62蛋白表達(dá)水平,說明體內(nèi)結(jié)果與體外一致,即UFPs抑制自噬性降解。進(jìn)一步,在體內(nèi)采用rapamycin加快自噬流干預(yù)UFPs誘導(dǎo)肺纖維化的過程后,檢測肺纖維化相關(guān)的表型。天狼腥紅染色結(jié)果表明,小鼠暴露UFPs后用rapamycin進(jìn)行干預(yù),膠原聚集顯著減輕；羥輔氨酸檢測結(jié)果顯示,rapamycin顯著下調(diào)小鼠肺組織中羥輔氨酸含量；此外,免疫組化結(jié)果可見rapamycin下調(diào)肺組織中α-SMA的表達(dá)量。以上結(jié)果充分證明rapamycin干預(yù)組小鼠肺纖維化明顯減輕,說明自噬流阻斷是UFPs誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)病機(jī)制。根據(jù)以上結(jié)果,我們得出結(jié)論：UFPs通過影響肺泡上皮細(xì)胞溶酶體酸化而抑制自噬性降解,導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞自噬紊亂,繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及上調(diào)炎癥因子表達(dá),從而介導(dǎo)了肺纖維化的發(fā)生。
[Abstract]:In order to explore the mechanism of pulmonary fibrosis and its contribution to the development of pulmonary fibrosis , it is concluded that the toxicity of particulate matter is closely related to the diameter distribution of particulate matter . In this paper , we examined the molecular mechanism of mouse lung fibrosis by Western blot and immunohistochemistry . The results showed that the expression of 偽 - SMA in lung tissue was significantly higher than that in the control group . In addition , the results showed that the autophagy disturbance induced by ultra - fine particles could regulate the expression level of IL - 1 and IL - 6 in lung tissues of mice .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563

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本文編號：1404601