本文關(guān)鍵詞：Trx-1重組載體轉(zhuǎn)染hucMSCs及肺纖維化模型的初步探索　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:特發(fā)性肺纖維化(IPF)的防治一直是各國(guó)重點(diǎn)開展研究的領(lǐng)域。目前應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒性藥物仍是其臨床上治療的主要措施,但并不能有效抑制肺纖維化的進(jìn)展,改善其肺功能或者延長(zhǎng)其生存期限。隨著對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制的理解加深,許多新型藥物不斷被研制出來,但其應(yīng)用于臨床方面仍然存在著諸多問題。因此,找尋出新的預(yù)防或治療方法迫在眉睫。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)能夠向組織損傷處趨化遷移,參與修復(fù)作用,同時(shí)容易被外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá),在特發(fā)性肺纖維化的治療方面已顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。由于涉及氧化應(yīng)激,N-乙酰半胱氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化劑也逐漸出成為特發(fā)性肺纖維化的新型治療措施。而硫氧還蛋白(Trx)作為一種抗氧化劑,除了能夠清除自由基,在抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等方面也具有非常重要的作用。所以,通過慢病毒轉(zhuǎn)染,我們構(gòu)建出目的基因Trx-1修飾的MSC,同時(shí)建立了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型,為基因修飾的MSC治療特發(fā)性肺纖維化奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:從NCBI網(wǎng)站查得Trx-1的CDS區(qū)序列,構(gòu)建針對(duì)CDS區(qū)的基因特異性引物,并在引物兩頭加上可以和慢病毒載體同源重組的15bp左右的序列。在載體酶切線性化后,進(jìn)行載體與基因片段的重組,將片段構(gòu)建到載體上,最后通過熒光直接觀察與Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證質(zhì)粒的表達(dá)效果并通過熒光觀察法計(jì)算得到病毒在293T細(xì)胞中的滴度。制備攜帶目的基因Trx-1的重組慢病毒Lentivirus-Trx-1,并測(cè)定病毒的滴度;設(shè)置一定的感染復(fù)數(shù)(MOI)梯度:0、5、10、30、50,用不同MOI值感染人臍帶MSC,通過觀察其熒光蛋白的表達(dá)確定其最佳MOI值,隨后以空載體轉(zhuǎn)染的人臍帶MSC和未轉(zhuǎn)染的人臍帶MSC作為對(duì)照,利用重組慢病毒以最佳MOI值感染人臍帶MSC,應(yīng)用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中目的蛋白Trx-1蛋白的表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的細(xì)胞周期、免疫表型;CCK-8法測(cè)定并繪制出細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;以博來霉素作為誘導(dǎo)劑,以C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分別按照5mg/kg的用量經(jīng)氣管內(nèi)注入博來霉素,或者按照用量約6mg/kg的用量經(jīng)鼻滴入博來霉素,建立兩種肺纖維化動(dòng)物模型,通過對(duì)其一般情況、體重的觀察和肺組織HE染色和Masson染色等病理染色,觀察并比較兩種造模方法的效果。結(jié)果:成功構(gòu)建了pGC-LV-Ubi-TRX-1-CMV-EGFP慢病毒載體質(zhì)粒,并通過Western Blot發(fā)現(xiàn)此質(zhì)粒在293T中成功表達(dá),并發(fā)生翻譯后修飾,同時(shí)利用293T細(xì)胞測(cè)得了病毒的滴度為1×108 TU/ml;當(dāng)MOI值為10及以上時(shí),MSC的感染效率均能達(dá)到80%以上,由于慢病毒可能具有細(xì)胞毒性,最佳MOI值確定為10。Western Blot檢測(cè)顯示各組細(xì)胞均能不同程度地表達(dá)Trx-1蛋白,并且實(shí)驗(yàn)組目的蛋白Trx-1的表達(dá)明顯增加;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),三組MSC均高表達(dá)CD105、CD73,不表達(dá)CD34、CD80等,符合MSC的表型特點(diǎn);細(xì)胞周期檢測(cè)顯示,慢病毒感染前后,人臍帶MSC均有80%以上的細(xì)胞處于G0/G1期,提示轉(zhuǎn)染慢病毒后的人臍帶MSC與轉(zhuǎn)染前類似,同樣具有典型的干細(xì)胞特性;而通過對(duì)其生長(zhǎng)曲線的觀察對(duì)比則發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染前不同,轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組人臍帶MSC生長(zhǎng)受到抑制;造模結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)氣管內(nèi)注入和經(jīng)鼻滴入博來霉素均能成功建立肺纖維化模型。但通過對(duì)進(jìn)行其病理纖維化評(píng)分后發(fā)現(xiàn),與氣管內(nèi)給藥相比,經(jīng)鼻給藥造模后小鼠肺組織病理改變較輕,提示氣管內(nèi)給藥更容易造模成功。結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶有人Trx-1基因的重組慢病毒載體,通過其介導(dǎo)獲得修飾的人臍帶MSC并能穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白Trx-1,且其細(xì)胞學(xué)特性無明顯改變;在本實(shí)驗(yàn)中,手術(shù)經(jīng)氣管內(nèi)注入博來霉素后第28天誘導(dǎo)建立的C57小鼠肺纖維化模型成模最好,是一種復(fù)制肺纖維化的較好模型;本研究將基因治療與細(xì)胞治療相結(jié)合,為治療特發(fā)性肺纖維化奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),提供了新的可能手段。
[Abstract]:Background: idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) prevention is always the key research field. The main measures are currently using glucocorticoid and cytotoxic drugs is the treatment of the progress, but it does not inhibit pulmonary fibrosis, improve lung function or prolong the survival period. With the pathogenesis of the disease understanding, many new drugs have been developed, but its clinical application still exist many problems. Therefore, to find new methods for preventing or treating imminent. Mesenchymal stem cells (MSC) can damage to tissue chemotactic migration, participate in the repair, and at the same time easily the expression of exogenous gene transfection, in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis has shown great application foreground. Due to oxidative stress, N- acetylcysteine, superoxide dismutase (SOD) and other antioxidants Gradually become a new treatment for idiopathic pulmonary fibrosis. And thioredoxin (Trx) as an antioxidant, in addition to the removal of free radicals, but also has a very important role in inhibiting apoptosis and regulating cell cycle. Therefore, the lentiviral transfection, we constructed the Trx-1 gene modified MSC also established a mouse model of pulmonary fibrosis induced by bleomycin, MSC gene modified for treatment of idiopathic pulmonary fibrosis provides a certain experimental basis. Methods: CDS sequences from the NCBI website Richard Trx-1, construct the gene specific primers for the CDS region, and sequence and lentiviral vectors homologous recombination of about 15bp in the two primers added. In vector linearized vector, and the recombinant gene fragment, the fragment into vector, finally by direct fluorescence observation and Western Blot experiment Effect of expression plasmid and verified by fluorescence observation method is used to calculate the viral titer in 293T cells. The recombinant lentiviral Lentivirus-Trx-1 preparation with Trx-1 gene, and the titer of virus was determined by setting a multiplicity of infection; (MOI) gradient: 0,5,10,30,50, with different values of MOI infected human umbilical cord MSC, the best MOI value to observe the expression determined by fluorescent protein, followed by transfected human umbilical cord MSC and untreated human umbilical cord MSC as control, the use of recombinant lentivirus to optimal MOI infection of human umbilical cord MSC, expression of target protein Trx-1 protein by Western Blot detection cell; cell cycle, flow cytometry detection cell with the immunophenotype; and determination to draw cell growth curve by CCK-8 method; bleomycin as inducers in C57BL/6J mice as experimental animal, respectively according to the amount of 5mg/kg intratracheal injection In bleomycin, or according to the amount of about 6mg/kg the dosage of intranasal instillation of bleomycin, established two kinds of animal models of pulmonary fibrosis, based on the general situation, and lung tissue HE staining and Masson staining pathological weight, observe and compare the two models the effect. PGC-LV-Ubi-TRX-1-CMV-EGFP was successfully constructed lentiviral vector plasmid, and by Western Blot found that the successful expression of the plasmid in 293T, and the occurrence of post-translational modifications, and 293T cells were measured by the titer of virus was 1 * 108 TU/ml; when the MOI value is 10 and above, the infection efficiency of MSC could reach more than 80%, because slow virus may have cell toxicity, the optimum MOI value was determined by 10.Western Blot assay showed that the cells in each group were different level of expression of Trx-1 protein and Trx-1 protein expression in the experimental group increased significantly; flow cytometry detection Now, three groups of MSC had high expression of CD105, CD73, the expression of CD34 CD80, consistent with the phenotype characteristics of MSC; cell cycle analysis showed that before and after lentivirus infection, human umbilical cord MSC cells were more than 80% in G0/G1 phase, suggesting that human umbilical cord MSC transfected with lentivirus after similar, with the same the typical characteristics of stem cells; by comparative observation on the growth curve of the found that, unlike before transfection, the experimental group transfected human umbilical cord MSC inhibited growth; modeling results show that intratracheal injection and intranasal instillation of bleomycin can induce pulmonary fibrosis. But according to the author the pathological fibrosis score, compared with intratracheal administration, intranasal administration after the model of mouse lung tissue pathological change is lighter, suggesting that intratracheal administration easier to model success. Conclusion: constructed the recombinant lentiviral vector of human Trx-1 gene, through The mediated modification of human umbilical cord MSC and overexpression of Trx-1 protein, and the cytological characteristics had no significant change; in this experiment, the operation by intratracheal injection of C57 mice model of pulmonary fibrosis in bleomycin induced twenty-eighth days after establishment of model best, is a good model of pulmonary fibrosis in this study; gene therapy and cell therapy combined, which provided the experimental basis for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis, may provide a new means.

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563

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本文編號(hào)：1398365