本文關(guān)鍵詞：骨骼肌缺血再灌注后肺損傷的發(fā)生機(jī)理及其防護(hù)研究　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景與目的：骨骼肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）損傷是臨床常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，缺血部位的循環(huán)重新建立后，局部組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能損傷可能會(huì)進(jìn)一步加重，還將導(dǎo)致多種遠(yuǎn)隔臟器的損傷，甚至引起全身炎癥反應(yīng)綜合癥（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）、器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，危及患者生命。肺是最易受損的遠(yuǎn)隔器官之一，肺損傷是骨骼肌IR、下肢嚴(yán)重創(chuàng)傷的常見(jiàn)并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)，與危重患者的高病死率明顯相關(guān)。骨骼肌缺血再灌注后肺損傷的發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，可能涉及炎癥反應(yīng)、水腫、氧化應(yīng)激、神經(jīng)體液因子的激活、免疫紊亂以及硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)體系的下調(diào)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renninangiotensin aldosterone system，RAAS）的激活等多個(gè)環(huán)節(jié)，共同作用導(dǎo)致肺功能的急劇減退。然而骨骼肌缺血再灌注后肺損傷的早期診斷及治療并不理想，其中的免疫炎性損傷、水代謝障礙機(jī)理，以及與H2S/CSE體系、RAAS的關(guān)系尚未明確，一直都是臨床及科研工作研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)：一、以我院雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者為研究對(duì)象，聯(lián)合采用Calra細(xì)胞分泌蛋白(Clara cell secretionprotein, CC16)及腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor, TNF α)、白介素(Interleukin, IL)中IL-1β、IL-6、IL-8炎性因子水平作為肺損傷外周血標(biāo)記物，探討雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后炎性損傷及肺泡-毛細(xì)血管膜受損在肺損傷過(guò)程的作用。二、在雙膝關(guān)節(jié)置換術(shù)臨床觀察的基礎(chǔ)之上，建立大鼠后肢I(xiàn)R及復(fù)合創(chuàng)傷模型，模擬止血帶所致的缺血再灌注及雙膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中骨及軟組織的復(fù)合創(chuàng)傷的病理生理過(guò)程，觀察單純IR及復(fù)合創(chuàng)傷所致肺損傷的程度，及肺組織損傷標(biāo)記物CC16水平的差異，同時(shí)關(guān)注水通道蛋白1(Aquaporins1，AQP1)、水通道蛋白5(Aquaporin5，AQP5)及TLR4(Toll-like receptors4)-毮樣分化初級(jí)反應(yīng)基因88(Myeloid differentiation primary-response gene88, MyD88)-核因子κB(nuclearfactor-κB, NF-κB)通路的表達(dá)，進(jìn)一步探討骨骼肌缺血再灌注及復(fù)合創(chuàng)傷后肺組織免疫炎性反應(yīng)、肺組織水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的機(jī)制。三、給予硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS)及炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PPG)干預(yù)肺組織內(nèi)源性H2S水平，或給予螺內(nèi)酯拮抗醛固酮（aldosterone，Ald）受體，深入尋求缺血再灌注損傷過(guò)程中介導(dǎo)肺組織損傷的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，探索干預(yù)及治療肺損傷的可行、有效的靶點(diǎn)。 方法：第一部分：行雙膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)病人15例，以Elisa或Liminex觀察術(shù)前、術(shù)后4h、術(shù)后12h外周血肺泡-毛細(xì)血管膜損傷的特異性標(biāo)記物CC16及TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8炎性損傷標(biāo)記物變化。第二部分：雄性Wistar大鼠22只，制備大鼠雙側(cè)后肢I(xiàn)R模型及后肢復(fù)合創(chuàng)傷模型，隨機(jī)分為3組，即①正常對(duì)照組(n=8)；②IR組(n=8)；③復(fù)合創(chuàng)傷組(n=6)。觀察肺組織HE染色及電鏡結(jié)果、以Real-time PCR法檢測(cè)肺組織CC16mRNA表達(dá)來(lái)評(píng)估肺損傷程度；計(jì)算肺組織濕/干重比值，采用免疫組化、Real-time PCR方法Western-blot、Real-time PCR方法檢測(cè)肺組織AQP1、AQP5的表達(dá)，評(píng)價(jià)肺水腫的形成，探討水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙機(jī)制；以類似方法檢測(cè)TLR4-Myd88-NF-κB通路mRNA及蛋白水平的變化，探究肺組織免疫炎性損傷機(jī)制。第三部分：雄性Wistar大鼠40只，制備大鼠雙側(cè)后肢I(xiàn)R模型，隨機(jī)分為5組，每組8只，即①正常對(duì)照組；②IR組；③IR+NaHS組：IR模型制作前腹腔注射NaHS0.78mg/kg；④IR+PPG組：IR模型制作前腹腔注射PPG60mg/kg；⑤IR+螺內(nèi)酯組：IR模型制作前每天予螺內(nèi)酯20mg/kg灌胃，共持續(xù)6天，評(píng)價(jià)肺損傷及肺水腫程度，采用免疫組化、Real-time PCR，以及Western-blot方法檢測(cè)肺組織AQP1、AQP5的表達(dá)，以及TLR4-Myd88-NF-κB通路mRNA及蛋白水平的變化，探討可行的干預(yù)措施及調(diào)節(jié)機(jī)制。 結(jié)果：第一部分：①雙側(cè)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后4小時(shí)患者血清CC16水平較術(shù)前明顯升高（P0.05），約是術(shù)前的2倍，術(shù)后12小時(shí)與正常組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。②術(shù)后4小時(shí)血清TNF-α、IL-6、IL-8濃度較術(shù)前明顯升高（P0.05），12小時(shí)后TNF-α恢復(fù)正常（與術(shù)前比較P0.05），IL-8水平下降但仍然高于術(shù)前水平（P0.05），IL-6水平較術(shù)后4小時(shí)繼續(xù)上升(P0.05)。術(shù)后IL-1β水平較術(shù)前比較無(wú)明顯差異（P0.05）。第二部分：①與正常組比較，IR組大鼠出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡隔增寬、肺水腫形成，肺組織CC16mRNA水平減低（P0.05），復(fù)合創(chuàng)傷組大鼠肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肺損傷程度進(jìn)一步加重，CC16mRNA水平減低更為明顯（與IR組比較，P0.05），標(biāo)志著肺泡上皮損傷加重。②與正常組比較，缺血再灌注組大鼠肺組織濕/干重比增加（P0.05），肺組織出現(xiàn)水腫，，肺組織AQP1、AQP5mRNA及蛋白水平減低（P0.05），復(fù)合創(chuàng)傷組肺濕干重增加更為明顯（與IR組比較，P0.05），AQP1、AQP5的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)（與IR組比較，P0.05），肺水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及肺水腫程度加重。③與正常組比較，IR組TLR4及MyD88的mRNA水平增加（P0.05），TLR4及p-NF-κB p65的蛋白合成增加（P0.05），這些變化在復(fù)合創(chuàng)傷組更為明顯（P0.05）。第三部分：①與IR組比較，IR+NaHS組及IR+螺內(nèi)酯組大鼠肺損傷減輕，肺組織CC16mRNA水平增加（P0.05），IR+PPG組肺組織損傷及水腫程度加重，CC16mRNA的合成更加減少（P0.05）。②與IR組比較，IR+NaHS組肺濕/干重比下降（P0.05），肺AQP1及AQP5蛋白及mRNA水平上調(diào)（P0.05）；IR+螺內(nèi)酯組肺濕/干重比下降（P0.05），AQP5蛋白及mRNA水平、AQP1mRNA水平增加(P0.05)，AQP1蛋白水平無(wú)明顯變化（P0.05）；IR+PPG組后肺濕/干重比升高P0.05），AQP1蛋白及mRNA水平、AQP5mRNA水平下降(P0.05)，AQP5蛋白水平無(wú)改變（P0.05）。③與IR組比較，IR+NaHS組及IR+螺內(nèi)酯大鼠肺TLR4、p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)及TLR4、MyD88mRNA水平明顯減低(P0.05)，IR+PPG組大鼠較IR組進(jìn)一步增加(P0.05)。 結(jié)論：1.雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后早期患者外周血CC16、TNF-α、IL-6及IL-8水平明顯升高，標(biāo)志著雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)術(shù)后早期即出現(xiàn)肺泡-毛細(xì)血管膜的損傷及炎性反應(yīng)的激活，提示著肺炎性損傷的發(fā)生。2.骨骼肌缺血再灌注可導(dǎo)致肺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及損傷，復(fù)合創(chuàng)傷可使肺組織的損傷水腫程度進(jìn)一步加重。3.骨骼肌缺血再灌注后肺組織AQP1、AQP5表達(dá)降低，TLR4-Myd88-NF-κB通路激活，大鼠后肢復(fù)合創(chuàng)傷可使AQP1、AQP5、TLR4-Myd88-NF-κB通路的變化更為明顯，導(dǎo)致肺組織水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙免疫炎性損傷，是骨骼肌缺血再灌注及創(chuàng)傷后肺損傷的重要環(huán)節(jié)。4. NaHS和螺內(nèi)酯可改善下肢骨骼肌缺血再灌注肺損傷、減輕肺水腫程度，PPG可加重肺損傷及肺水腫程度，這種調(diào)節(jié)作用至少部分是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4-Myd88-NF-κB通路以及AQP1、AQP5的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。NaHS及螺內(nèi)酯作為骨骼肌缺血再灌注后肺損傷的防治措施，具有一定的可行性及有效性。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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