本文關鍵詞：不明原因肺炎病例病原宏基因組學研究　出處：《中國疾病預防控制中心》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：細菌和病毒均可造成不明原因肺炎,許多新發(fā)傳染病也常常引起不明原因肺炎。因此,對不明原因肺炎病原的準確鑒定和特征分析對臨床治療和公共衛(wèi)生都具有重要意義。然而,盡管檢測技術不斷進步,目前對于不明原因肺炎的病原認識依然有限。宏基因組學方法可對病例臨床樣本中所有微生物進行基于序列的分析,相比傳統(tǒng)的Real-time PCR等方法,宏基因組學方法無需預知病原的背景信息,能對臨床樣本中所有微生物進行全面檢測,同時獲得病原的基因組信息,非常適合不明原因肺炎病原研究。近年來,下一代測序技術(Next generation sequencing, NGS)取得了巨大進展,極大的提高了宏基因組學在臨床上應用。但使用宏基因組學進行不明原因肺炎病原研究,常常會遇到核酸的偏好性擴增、宿主基因組成分比例過高以及數據分析困難等各種挑戰(zhàn)。本研究通過對臨床樣本進行低速離心和過濾去除宿主細胞組分,核酸酶消化去除外源性核酸等方法,極大的降低了NGS測序數據中宿主基因組成分。在微量核酸擴增方法的選擇上,我們評估了多重置換擴增(Multiple displacement amplification, MDA)和單引物等溫擴增(Single primer isothermal amplification, SPIA)對呼吸道病原鑒定的能力,結果顯示SPIA擴增均一性和病原檢測能力均優(yōu)于MDA,可將其作為隨后病原鑒定的擴增方法。我們將建立的這套基于NGS的宏基因組學病原檢測方法用于33份2013-2014年貴州省排除了流感和SARS病毒后的不明原因肺炎病例病原研究,經過樣本預處理和SPIA擴增,利用Ion Torrent和Illumina MiSeq兩個平臺進行RNA-Seq二代測序。經過宏基因組學分析,在16份樣本中檢測出了13種病毒,其中鼻病毒C的比例最高。而且宏基因組學方法還可以獲得病毒的全基因組序列信息進行進一步的進化和序列分析。對于RNA-Seq未能檢測到呼吸道病原的17份樣本,我們提取了樣本DNA直接進行二代測序和宏基因組學分析。DNA-Seq未能在這些樣本中發(fā)現DNA病毒,但微生物菌群分析顯示,在這些患者的上呼吸道中分布著很高比例的Streptococcus 。而在Streptococcus中,機會病原菌SStreptococcus pneumonia的比例最高。不明原因肺炎病例往往經過抗生素治療而無效。本研究將DNA-Seq結果與微生物耐藥性數據庫進行比對,發(fā)現絕大部分不明原因肺炎患者的上呼吸道細菌中,均攜帶有大量的耐藥性基因,其中針對抗生素Beta-lactam, Tetracycline和Macrolide的耐藥性基因數目最多。這些耐藥性基因廣泛分布在多個細菌分類群中,而其中Bacteroidales, Lactobacillales, Pseudomonadales是主要的耐藥基因來源宿主菌。在部分樣本中,Streptococcus和A.baumannii的比例很高,而這些細菌中耐藥性基因比例同樣很高,暗示細菌的耐藥性基因豐度可能與該細菌的菌群豐度呈現一定的相關關系,或許可以作為臨床治療的靶點。綜上所述,本研究建立了基于NGS的宏基因組學病原檢測和特征分析技術平臺。利用該平臺,我們對收集到的貴州省2013～2014年的不明原因肺炎樣本進行了RNA-Seq深度測序。結果顯示鼻病毒C是不明原因肺炎病例最常見的病毒性病原。對RNA-Seq呼吸道病毒陰性的樣本進行DNA-Seq,結果顯示部分不明原因肺炎患者樣本中含有很高比例的機會病原菌,且存在大量的耐藥性基因。機會病原菌攜帶的耐藥性基因比例與這些細菌在樣本中比例呈現一定的相關關系,說明這些機會病原菌攜帶的耐藥性基因可能造成了這些細菌在不明原因肺炎病例中的超量增值,并可能作為未來臨床治療的靶點。這些結果提供了不明原因肺炎患者的上呼吸道的病毒組、細菌組和耐藥組的初步信息,為今后不明原因肺炎患者的病原鑒定和特征分析提供了技術平臺。
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R563.1

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