本文關(guān)鍵詞：Nogo-B調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在急性肺損傷后期肺間質(zhì)纖維化中的作用

  更多相關(guān)文章： Nogo-B 急性肺損傷 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 肺間質(zhì)纖維化

【摘要】：研究背景:急性肺損傷(Acute lung injury,ALI),即急性呼吸窘迫綜合癥(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),是一種常見的呼吸系統(tǒng)危重癥。盡管采取了綜合的治療手段,其死亡率仍居高不下。即便是部分安全渡過(guò)急性期的病人,在其ARDS后期纖維增生階段,肺部發(fā)生成纖維細(xì)胞聚集、膠原沉積等纖維增生反應(yīng),如無(wú)法有效逆轉(zhuǎn),會(huì)導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化,使這些患者出現(xiàn)機(jī)械通氣依賴、生活質(zhì)量下降等問題。而肺的纖維增生主要有三種來(lái)源:肺上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)形成成纖維細(xì)胞,循環(huán)成纖維細(xì)胞募集入肺,以及肺固有成纖維細(xì)胞活化增殖。網(wǎng)狀蛋白4(Reticulon4B,RTN4B),也稱軸突生長(zhǎng)抑制劑-B(inhibitor of neurite outgrowth-B,Nogo-b),是網(wǎng)狀蛋白家族的一員,主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。新近研究表明,它與炎癥發(fā)生及損傷修復(fù)均密切相關(guān),在肝纖維化的發(fā)生、宮頸癌細(xì)胞He La細(xì)胞EMT反應(yīng)中都起到重要作用。本課題組前期研究證實(shí),Nogo-B在肺泡上皮細(xì)胞表達(dá),且在ALI發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。那么,Nogo-B在ALI后期纖維增生階段扮演怎樣的角色呢?本課題旨在明確Nogo-B在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型后期肺間質(zhì)纖維化的作用,以期為明確該疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制乃至為治療策略的制定有所幫助。研究方法:一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(一)實(shí)驗(yàn)對(duì)象:野生型C57BL/6小鼠及Nogo-B敲除小鼠,6-8周,雄性。(二)造模及分組:通過(guò)脂多糖(lipopolusaccharide,LPS)氣管滴入構(gòu)建小鼠的ALI模型,以等量磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)滴入構(gòu)造正常對(duì)照模型。隨機(jī)分組,收集正常對(duì)照組、造模第一天組、造模第四天組、造模第七天組及造模第十天組小鼠的肺組織標(biāo)本。(三)檢測(cè)方法:通過(guò)病理切片、Masson染色、免疫組化、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitiative PCR,rt-q PCR)、蛋白印跡試驗(yàn)(Western Blot,WB)等檢測(cè)Nogo-B在ARDS中的表達(dá)變化,明確Nogo-B是否參與ARDS后期的纖維增生的過(guò)程。同時(shí),檢測(cè)纖維增生主要誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)以及標(biāo)志分子上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、平滑肌肌動(dòng)蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)變化,明確ALI模型后期是否發(fā)生肺間質(zhì)纖維化,以及Nogo-B的敲除是否會(huì)對(duì)纖維增生反應(yīng)有所影響。(一)研究對(duì)象:小鼠肺泡上皮細(xì)胞株(MLE-12)(二)造模及分組:選用小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)干擾建立Nogo-B低表達(dá)MLE組,設(shè)立空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(Negtive si RNA),并通過(guò)TGFβ1誘導(dǎo)MLE細(xì)胞EMT反應(yīng),收集細(xì)胞蛋白及RNA。(三)檢測(cè)方法:通過(guò)rt-q PCR、WB對(duì)比Nogo-B低表達(dá)MLE組與對(duì)照組在TGFβ1誘導(dǎo)下Nogo-B表達(dá)變化,及EMT反應(yīng)中上皮及間質(zhì)分子標(biāo)記表達(dá)變化,進(jìn)一步明確Nogo-B在其中的作用。二、體外實(shí)驗(yàn):研究結(jié)果:一、小鼠急性肺損傷模型中Nogo-B表達(dá)變化及其與后期肺間質(zhì)纖維化形成的關(guān)聯(lián)性研究LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型的病理切片顯示,造模第一天小鼠肺部炎癥較重,第四天炎癥反應(yīng)逐漸減輕而纖維化加重,至第七天和第十天,炎癥基本消退而肺纖維化明顯。而正常對(duì)照組小鼠既有少量Nogo-B表達(dá),造模第一天明顯下降,第四天后逐漸增高,高表達(dá)持續(xù)至第七天,與纖維增生反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間趨勢(shì)一致。同時(shí),在造模第一天,纖維增生反應(yīng)主要誘導(dǎo)因子TGFβ即釋放增加,上皮表面標(biāo)記E-cadherin表達(dá)明顯下降,而隨著時(shí)間推進(jìn),上皮細(xì)胞位置逐漸出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表面分子α-SMA及Vimentin表達(dá)。第七及第十天TGFβ持續(xù)表達(dá)較高,E-cadherin表達(dá)明顯下降而α-SMA及Vimentin表達(dá)增高。結(jié)果提示Nogo-B與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生相關(guān)。二、調(diào)控Nogo-B表達(dá)對(duì)小鼠急性肺損傷模型炎癥反應(yīng)及后期肺間質(zhì)纖維化的影響LPS誘導(dǎo)的Nogo-B敲除小鼠與野生型小鼠相比,正常對(duì)照組肺組織切片表現(xiàn)基本一致,而造模第一天敲除鼠炎癥程度明顯較野生型重,至第七天仍有部分炎癥反應(yīng)而野生型小鼠炎癥基本吸收,而第十天與正常組小鼠相比,纖維化程度較正常小鼠輕。同時(shí),在ALI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,敲除鼠與野生型小鼠相比,TGFβ表達(dá)變化基本一致,而第七天及第十天α-SMA及Vimentin表達(dá)較低,提示Nogo-B敲除小鼠雖然經(jīng)歷更重的炎癥反應(yīng),但是后期纖維化反應(yīng)減輕。三、調(diào)控Nogo-B表達(dá)對(duì)小鼠急性肺損傷模型后期肺間質(zhì)纖維化影響的可能的機(jī)制探討已有文獻(xiàn)表明,在肺間質(zhì)纖維化的過(guò)程中EMT反應(yīng)在其中起到了重要作用。通過(guò)對(duì)MLE-12細(xì)胞進(jìn)行si RNA干擾Nogo-B表達(dá)和TGFβ1誘導(dǎo)EMT反應(yīng),發(fā)現(xiàn),TGFβ1誘導(dǎo)下Nogo-B表達(dá)明顯升高,而進(jìn)行Nogo-B干擾發(fā)現(xiàn),干擾組上皮細(xì)胞上皮表面標(biāo)記E-cadherin表達(dá)較未干擾組較高而間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記α-SMA及Vimentin表達(dá)較低,提示下調(diào)Nogo-B影響了TGFβ對(duì)細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)。通過(guò)對(duì)主要信號(hào)通路分子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),下調(diào)Nogo-B組Smad2磷酸化水平下降,說(shuō)明Nogo-B能通過(guò)干擾TGFβ/Smad2通路影響MLE細(xì)胞的EMT反應(yīng)。研究結(jié)論:一、在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中,后期發(fā)生了肺間質(zhì)纖維化,并且Nogo-B參與了LPS誘導(dǎo)小鼠ALI過(guò)程中的炎癥發(fā)生及纖維增生反應(yīng)。二、Nogo-B敲除鼠與野生型小鼠相比,前期炎癥反應(yīng)較重而后期纖維化較輕,進(jìn)一步證實(shí)了Nogo-B的存在對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型中的炎癥及肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展有保護(hù)性作用。三、Nogo-B可以通過(guò)TGFβ/Smad通路影響TGFβ1誘導(dǎo)的MLE細(xì)胞株EMT反應(yīng)過(guò)程,提示Nogo-B可能是通過(guò)影響EMT反應(yīng)影響ALI小鼠后期肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 平國(guó)強(qiáng);唐錦玲;楊春青;;改良Masson三色染色法在應(yīng)用中的體會(huì)[J];實(shí)用醫(yī)技雜志;2014年06期

2 鐘玉華;彭福華;;勿動(dòng)蛋白及NgR的下游信號(hào)通路研究進(jìn)展[J];新醫(yī)學(xué);2013年11期

3 胥武劍;沈國(guó)慶;李強(qiáng);;Nogo-B的生物學(xué)功能[J];生理學(xué)報(bào);2013年04期

4 朱瑩;胥武劍;寧允葉;吳琳;盧建;李強(qiáng);;Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制備[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年08期

5 賀松;張德純;;基因敲除方法及其應(yīng)用[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2009年02期

6 ;RNA interference and antiviral therapy[J];World Journal of Gastroenterology;2007年39期

7 王玨;朱禮國(guó);唐幕湘;張健;;改良Masson三色染色法在膠原纖維中的應(yīng)用[J];鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年01期

，

本文編號(hào)：1288714