本文關(guān)鍵詞：自噬在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：1.背景與目的肺泡上皮細(xì)胞是急性肺損傷(acute lung injury,ALI)時受損的重要靶細(xì)胞,肺泡上皮細(xì)胞死亡是急性肺損傷的顯著特征。肺泡上皮細(xì)胞損傷在ALI的發(fā)病中具有重要作用,也是評估預(yù)后的重要指標(biāo)。內(nèi)毒素是導(dǎo)致急性肺損傷的重要因素,其主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在ALI中起重要作用,目前認(rèn)為過激的LPS-鐘形受體4(toll like receptor 4,TLR4)應(yīng)答所致的炎癥反應(yīng)失控是導(dǎo)致彌漫性肺泡損傷的重要原因,然而糖皮質(zhì)激素等抗炎藥物療效有限,未能有效降低其病死率,使用促炎因子腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)受體拮抗劑患者亦未獲益,因此對LPS導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制進(jìn)行深入研究,可望為ARDS的防治提供新的靶點和思路。自噬對細(xì)胞有著兩方面的作用,既可以作為一種促細(xì)胞生存的保護(hù)機(jī)制,又有促細(xì)胞死亡的作用,自噬的過度激活/抑制及功能失調(diào)在許多疾病中都起著重要的作用。目前一致認(rèn)為:自噬促進(jìn)細(xì)胞存活還是死亡取決于特異性刺激、環(huán)境條件及細(xì)胞類型。目前已證實,LPS刺激能使人肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞存活率下降,既往對其死亡機(jī)制的研究主要集中在依賴于Caspase的凋亡,但自噬在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中是促進(jìn)了細(xì)胞的存活還是誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡,目前還尚不明確。我們的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn):LPS能使人肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞自噬水平增加,然而,增高的自噬是細(xì)胞受到LPS刺激時的保護(hù)性反應(yīng)還是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因尚不明確,且其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。細(xì)胞自噬在生物體內(nèi)受嚴(yán)格而精細(xì)的調(diào)控,越來越多的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其觸發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)參與誘導(dǎo)激活細(xì)胞自噬。雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase,PERK),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶(inositol-requiring enzvme-1,IRE-1)及活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)是未折疊蛋白反應(yīng)三條信號通路的重要感受器分子。研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)在決定細(xì)胞死亡或生存起重要作用。然而,LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及未折疊蛋白反應(yīng)有關(guān)尚不清楚。本研究:(1)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)或工具藥物抑制/增強(qiáng)人肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞自噬,明確自噬在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡過程中的作用;(2)復(fù)制LPS所致ali小鼠模型,觀察干預(yù)自噬對肺泡上皮屏障功能的影響,從整體水平驗證肺泡上皮自噬與ali肺泡上皮屏障功能障礙的關(guān)系;(3)應(yīng)用rna干擾技術(shù)抑制a549細(xì)胞中由lps引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激繼之活化的未折疊蛋白反應(yīng)信號通路中的關(guān)鍵蛋白,檢測自噬活化標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞存活的變化,進(jìn)一步探討lps誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞自噬的機(jī)制;本研究將進(jìn)一步闡明自噬對肺泡上皮細(xì)胞死亡的調(diào)控作用及機(jī)制,初步揭示肺泡上皮細(xì)胞自噬在lps所致ali發(fā)病中的作用,為ali的臨床治療提供部分理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。2.研究方法(1)自噬在lps誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞株a549細(xì)胞死亡中的作用①lps刺激a549細(xì)胞模型,通過免疫印跡檢測自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3b(microtubule-associatedprotein1lightchain3b,lc3b)、beclin-1、自噬相關(guān)基因(autophagyrelatedgenes,atg)5及降解底物蛋白p62的表達(dá)變化;電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變;a549細(xì)胞轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,egfp)-lc3質(zhì)粒后予lps刺激,激光共聚焦顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染egfp-lc3融合蛋白的集聚變化;使用lps抑制劑多粘菌素b進(jìn)一步確定增加的自噬是否有賴于lps的特異性刺激;②cck-8實驗檢測不同濃度的lps對a549細(xì)胞的毒性作用,并取最低有毒劑量處理細(xì)胞后,觀察細(xì)胞壞死及凋亡變化;凋亡抑制劑預(yù)處理a549細(xì)胞后予最低有毒劑量lps刺激,觀察細(xì)胞存活率,進(jìn)一步驗證凋亡是否參與lps誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡的作用;③自噬抑制劑或增強(qiáng)劑預(yù)處理a549細(xì)胞后予lps刺激,觀察細(xì)胞存活率,研究自噬對lps誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡的作用;④使用特異性小干擾rna(shortinterferingrna,sirna)抑制肺泡上皮細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白beclin-1或atg5的表達(dá)后,再予lps刺激,觀察抑制自噬對細(xì)胞存活的影響,用遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗證自噬在lps誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡中的作用。(2)自噬抑制劑對lps誘導(dǎo)的ali小鼠肺泡上皮屏障功能障礙的保護(hù)作用①建立lps誘導(dǎo)的ali小鼠模型,免疫印跡檢測肺組織自噬蛋白的表達(dá)變化,免疫熒光觀察肺組織自噬蛋白的表達(dá)變化及細(xì)胞定位,透射電子顯微鏡檢測肺泡上皮細(xì)胞自噬超微結(jié)構(gòu);②使用自噬藥物抑制劑后,觀察肺損傷評分、肺濕干重比、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,balf)總蛋白的變化,用工具藥從整體上驗證干預(yù)自噬是否對lps誘導(dǎo)的ali小鼠肺泡上皮屏障功能障礙起保護(hù)作用;(3)lps誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞株a549細(xì)胞自噬性死亡的機(jī)制①lps刺激a549細(xì)胞后,觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulatedprotein,grp)78、grp94的表達(dá)變化;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑作用下觀察自噬標(biāo)志物lc3b-Ⅱ的變化,研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對自噬的影響;②lps刺激a549細(xì)胞后,觀察未折疊蛋白反應(yīng)的三條信號通路perk、ire1及atf6的關(guān)鍵蛋白表達(dá)變化;用sirna干擾技術(shù)分別抑制相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵蛋白,檢測自噬活化標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞存活變化,從細(xì)胞水平確定lps激活肺泡細(xì)胞自噬性死亡的相關(guān)信號通路。3.結(jié)果(1)lps處理a549細(xì)胞后,自噬蛋白lc3b-Ⅱ的轉(zhuǎn)化及beclin-1、atg5的表達(dá)呈時間及劑量依賴性增加,自噬降解底物蛋白p62水平則呈時間及劑量依賴性減少;lps抑制劑多粘菌素b預(yù)處理能抑制lps誘導(dǎo)的lc3b-Ⅱ增加;與對照組比較,lps處理組egfp-lc3點狀聚集數(shù)顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);電鏡觀察lps處理組可見自噬體;(2)與0?g/ml比較,小于50μg/ml的lps處理組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),50,100,150μg/ml的lps處理16h后,細(xì)胞存活率下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05,p0.01,p0.01),且細(xì)胞的存活率隨著lps濃度增加而減少,表現(xiàn)為劑量依賴效應(yīng)。多粘菌素b預(yù)處理能抑制lps所致的細(xì)胞存活率下降(p0.05);(3)50μg/ml的lps刺激a549細(xì)胞16小時,細(xì)胞凋亡數(shù)及乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,ldh)泄漏率(細(xì)胞壞死標(biāo)志物)與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);(4)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-ma)預(yù)處理能降低lps誘導(dǎo)的lc3b-Ⅱ增加及細(xì)胞存活率的下降(p0.05);自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin,rapa)預(yù)處理則增加了lps誘導(dǎo)的lc3b-Ⅱ增加及細(xì)胞存活率的下降(p0.05)。與對照組比較,凋亡抑制劑預(yù)處理組細(xì)胞存活率增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義p0.05);(5)特異性sirna能有效抑制beclin-1及atg5的表達(dá)和lps誘導(dǎo)的lc3b-Ⅱ的轉(zhuǎn)化、egfp-lc3點狀聚集數(shù)的增加及細(xì)胞存活率的下降(p0.05);(6)15mg/kg的lps腹腔注射小鼠16小時后,肺損傷評分,balf中促炎因子il-1β、tnf-α、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(macrophageinflammatoryprotein-2,mip-2)水平、細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例、總蛋白,以及肺濕干重比較對照組增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);(7)Western blot結(jié)果顯示,與生理鹽水對照組比較,LPS處理8h后小鼠肺組織中LC3B-Ⅱ的表達(dá)增加,16 h后增加明顯;免疫熒光檢測顯示LPS處理16 h后小鼠肺組織中LC3B的表達(dá)增加,且LC3B能夠和肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(pulmonary surfactant associated protein C,SPC)進(jìn)行共標(biāo),透射電鏡結(jié)果顯示,LPS處理16 h后小鼠肺肺泡上皮內(nèi)有較多自噬小體,而生理鹽水對照組細(xì)胞中未觀察到自噬小體的存在;(8)與對照組比較,3-MA或氯喹(chloroquine,CLQ)預(yù)處理組小鼠BALF中的總蛋白、肺濕干重比及肺損傷評分明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3-MA預(yù)處理組中,BALF中的促炎因子無變化,而CLQ預(yù)處理則明顯減少了BALF中的促炎因子IL-1β,TNF-α,MIP-2水平(P0.01);(9)LPS處理A549細(xì)胞后,GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)呈時間及劑量依賴性增加;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)能抑制LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化;(10)LPS處理A549細(xì)胞后,磷酸化的PERK(phosphorylated PERK,p-PERK)及其下游信號分子磷酸化的真核啟動因2(phosphorylated eukaryotic initiation factor-2,p-e IF2α)、ATF4、生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest DNA damage gene 34,GADD34)的表達(dá)呈時間及劑量依賴性增加,剪接型X盒結(jié)合蛋白1(splicing of X box binding protein 1,sXBP1),ATF6的表達(dá)無變化;(11)特異性siRNA能有效抑制PERK及ATF4的表達(dá)和LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化、EGFP-LC3點狀聚集數(shù)的增加及細(xì)胞存活率的下降(P0.05)。4.結(jié)論(1)自噬在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡過程中起促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用,最小細(xì)胞毒劑量的LPS可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞自噬性死亡;(2)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺泡上皮細(xì)胞自噬增強(qiáng),抑制自噬能改善小鼠肺泡屏障功能的障礙;(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)PERK-eIF2α-ATF4-GADD34信號通路參與了LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬性死亡。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563

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本文編號：1207397