發(fā)布時間：2017-11-19 14:11

  本文關(guān)鍵詞：脂多糖協(xié)同多聚左旋精氨酸誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌IL-6、IL-8的JNK信號通路研究

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【摘要】：目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)協(xié)同多聚左旋精氨酸(Poly-L-arginine,PLA)誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌白介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-8的信號通路機(jī)制。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)用常規(guī)培養(yǎng)基(10%胎牛血清+90%RPMI1640培養(yǎng)液)體外培養(yǎng)NCI-H292細(xì)胞,置于37℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài),一般每3-4天傳代1次。取最佳生長狀態(tài)的細(xì)胞,以約3×105/500μl的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。2.Western Blot檢測JNK磷酸化水平按照實驗設(shè)計,將NCI-H292細(xì)胞分為PLA(5μg/ml)組、LPS(5μg/ml)組、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)組,每組刺激時間分別為0、15min、30min、45min、60min、90min、120min,采用Western Blot檢測各組細(xì)胞在不同時間點的JNK、p-JNK蛋白含量,以β-actin作內(nèi)參,并分析比較不同時間點的p-JNK/JNK比值;將NCI-H292細(xì)胞分為空白對照組、PLA(5μg/ml)組、LPS(5μg/ml)組、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)組,采用Western Blot檢測比較各組細(xì)胞內(nèi)的JNK、p-JNK蛋白含量,并比較JNK信號通路特異性抑制劑SP600125(30μM)作用前后對JNK磷酸化的影響。3.ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-8按照實驗設(shè)計,將NCI-H292細(xì)胞分為空白對照組、PLA(5μg/ml)組、LPS(5μg/ml)組、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)組、PLA(5μg/ml)+SP600125(30μM)組、LPS(5μg/ml)+SP600125(30μM)組、PLA(5μg/ml)+LPS(5μg/ml)+SP600125(30μM)組和SP600125(30μM)組,根據(jù)實驗分組要求先加入JNK信號通路特異性抑制劑SP600125,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,預(yù)先刺激2h后,再加入PLA或/和LPS。共同培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒檢測各組的IL-6和IL-8表達(dá)情況,比較各組間存在的差異。4.統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗均重復(fù)3次。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理、分析實驗數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用?x±s表示,單因素方差分析(One-Way ANOVA)用于多組間的比較;LSD(least significant difference)檢驗用于兩兩間比較方差齊時,方差不齊時采用Dunnett,s T3檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.PLA作用NCI-H292細(xì)胞一定時間(15min、30min、45min、60min、90min、120min)后JNK磷酸化水平均增加,與空白對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.01),且JNK磷酸化隨時間延長而增加,45min達(dá)到高峰(P0.001)后下降。2.LPS作用時間為15min、30min、45min、60min、90min、120min時,JNK磷酸化水平較空白對照組均增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05),與PLA類似的是45min之前呈上升趨勢,45min為JNK磷酸化高峰(P0.01),45min后為下降趨勢。3.PLA+LPS作用NCI-H292細(xì)胞15min、30min、45min、60min、90min、120min,JNK磷酸化水平較空白對照組顯著增加,并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.001),PLA+LPS的作用高峰提前至30min(P0.01),45min時較前下降(P0.001),在60min時再次增加后減少(P0.001),30min的JNK磷酸化水平高于60min,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4.PLA+LPS組的JNK磷酸化水平顯著高于PLA組或LPS組,PLA+LPS組與PLA組、LPS組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.001)。5.SP600125能明顯減少PLA或/和LPS刺激NCI-H292細(xì)胞的JNK磷酸化水平增加(P均0.001)。6.與空白對照組比較,PLA組、LPS組和PLA+LPS組的NCI-H292細(xì)胞內(nèi)IL-6和IL-8的表達(dá)明顯增加(P均0.01),并且PLA+LPS組明顯高于PLA組或LPS組(P均0.001);SP600125能明顯抑制PLA組、LPS組和PLA+LPS組的NCI-H292細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8(P均0.01)。結(jié)論:1.PLA、LPS能激活NCI-H292細(xì)胞內(nèi)的JNK信號通路,并且兩者具有協(xié)同效應(yīng)。2.LPS能協(xié)同PLA促進(jìn)NCI-H292細(xì)胞分泌IL-6和IL-8。3.JNK信號通路參與LPS協(xié)同PLA誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌IL-6、IL-8的過程。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R562.25

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