本文關(guān)鍵詞：Paralemmin-3在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及其機制研究

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【摘要】：研究目的構(gòu)建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)重組腺病毒載體,以所構(gòu)建的重組腺病毒載體感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞和大鼠,在體內(nèi)和體外實驗中探討PALM3在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用;同時利用免疫共沉淀檢測LPS刺激后PALM3是否與TLR4信號通路中的接頭分子MyD88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6存在相互作用,以探討下調(diào)PALM3表達對急性肺損傷保護作用的分子機制。研究方法1.靶向大鼠PALM3基因的shRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定按RNAi設(shè)計原則,分別設(shè)計3條針對大鼠PALM3基因的shRNA,插入穿梭質(zhì)粒pGV120-EGFP,并行PCR、測序鑒定,采用AdMAXTM包裝系統(tǒng)將穿梭質(zhì)粒pGV120-EGFP和骨架質(zhì)粒pBHGlox-E1,3Cre共轉(zhuǎn)入包裝293細胞中,包裝出靶向大鼠PALM3基因shRNA重組腺病毒載體Ad.PALM3-shRNA-1,Ad.PALM3-shRNA-2,Ad.PALM3-shRNA-3,擴增并純化重組腺病毒后采用TCID50法測定病毒滴度。通過酶消化法分離大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(AECⅡ),經(jīng)差速離心和免疫黏附法純化AECⅡ,進行原代培養(yǎng)并采用肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(SP-C)對AECⅡ鑒定。針對不同PALM3靶序列的重組腺病毒(Ad.PALM3-shRNA-1,Ad.PALM3-shRNA-2,Ad.PALM3-shRNA-3)分別轉(zhuǎn)染AECⅡ細胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并確定感染復(fù)數(shù)(MOI)值,Western Blot檢測AECⅡ中PALM3蛋白的表達水平,評價三組重組腺病毒的干擾效率,選擇干擾效率最佳的重組腺病毒用于后續(xù)實驗。2.干擾PALM3表達對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護作用依據(jù)第1部分實驗結(jié)果,選擇干擾效率最佳的Ad-PALM3-shRNA-1用于后續(xù)實驗。用經(jīng)鼻滴注的方法,以3×108PFU/只的劑量的建立大鼠重組腺病毒ad.palm3-shrna感染模型組(ad.palm3-shrna組),同時用空病毒載體ad-egfp(ad.egfp組)和pbs(control組)作為對照。感染48h后,以lps(10mg/kg)腹腔注射復(fù)制內(nèi)毒素性急性肺損傷模型。在lps刺激后的0h、3h、6h、12h、24h和48h各時間點分別用rt-pcr和westernblot檢測palm3mrna和蛋白表達情況;同時對比各組間的肺組織病理改變以及模型大鼠的7d存活率的變化;用elisa法分別檢測各組肺泡灌洗液中和血清中的tnf-α、il-1β、il-6及mpo表達水平的變化;用elisa法檢測肺組織勻漿中核轉(zhuǎn)錄因子nf-κb的活性變化。3.干擾palm3表達抑制lps誘導(dǎo)的大鼠aecⅡ細胞炎癥反應(yīng)依據(jù)第1部分實驗結(jié)果,選擇干擾效率最佳的ad-palm3-shrna-1用于后續(xù)實驗。以大鼠aecⅡ細胞為實驗對象,實驗共分為3組:ad.palm3-shrna組(轉(zhuǎn)染重組腺病毒ad.palm3-shrna-1),ad.egfp組(轉(zhuǎn)染空腺病毒載體ad.egfp)及control組(加入等體積pbs)。轉(zhuǎn)染48h后,3組細胞均給予lps(10μg/ml)刺激,lps刺激后0h,3h,6h,12h,24h,48h收集細胞和細胞上清液,分別應(yīng)用westernblot及pcr檢測三組細胞中palm3蛋白和mrna表達水平,用elisa法分別檢測各組細胞上清液中炎性因子tnf-α、il-1β和il-6的表達水平及細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子nf-κb活性。4.驗證palm3是否與lps-tlr4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的接頭分子存在相互作用研究結(jié)果1.成功構(gòu)建了三組靶向大鼠PALM3基因sh RNA的重組腺病毒載體:Ad.PALM3-sh RNA-1、Ad.PALM3-sh RNA-2、Ad.PALM3-sh RNA-3,感染滴度分別是3×1010pfu/ml、2×1010pfu/ml和3×1010pfu/ml,均符合實驗要求;AECⅡ細胞原代培養(yǎng)成功,細胞生長狀態(tài)良好,經(jīng)SP-C免疫熒光鑒定成功。重組腺病毒轉(zhuǎn)染AECⅡ后24h可見綠色熒光表達,48h熒光強度最高,最佳MOI值為200。三組重組腺病毒以相同MOI值轉(zhuǎn)染AECⅡ48h后,與正常細胞及空白對照組相比,抑制PALM3蛋白表達被抑制,其中Ad.PALM3-sh RNA-1的干擾效率最佳備選用于后續(xù)實驗。2.正常大鼠肺組織中存在PALM3的表達,LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型中肺組織內(nèi)PALM3的表達增加。與Control組及Ad.EGFP組相比,Ad.PALM3-sh RNA組LPS腹腔注射后各時間點大鼠肺內(nèi)PALM3的表達下調(diào)(P0.05);與Control組及Ad.EGFP組相比,Ad.PALM3-sh RNA組大鼠肺組織的病變減輕、血清中及肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO表達水平下降、肺組織中NF-κB活性降低、肺損傷大鼠7d存活率顯著提高(P0.05)。3.給予內(nèi)毒素刺激后,隨著作用時間的延長,大鼠AECⅡ中的PALM3的表達增加,重組腺病毒Ad.PALM3-sh RNA轉(zhuǎn)染后成功下調(diào)AECII中PALM3的表達(P0.05);給予LPS刺激后,與Ad.EGFP組和Control組相比,Ad.PALM3-sh RNA組細胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量減少,核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性受抑(P0.05)。4.在AECII細胞中給予LPS刺激與否,均存在PALM3、My D88、TICAM-2、IRAK-1、TRAF-6五種蛋白的表達;CO-IP結(jié)果證實PALM3與IRAK-1存在天然相互結(jié)合,并不依賴于LPS刺激,而給予LPS刺激后,在大鼠ACEⅡ中PALM3能以配體依賴的方式與TIACM-2、TRAF-6相互結(jié)合。結(jié)論1.干擾PALM3表達能減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞炎癥反應(yīng),對內(nèi)毒素性大鼠急性肺損傷具有保護作用;2.PALM3可能是參與LPS-TLR4信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵接頭分子之一,下調(diào)PALM3表達對ALI的保護作用可能是通過阻礙LPS-TLR4信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)而實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563

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