本文關(guān)鍵詞：丙酮酸乙酯對TDI哮喘氣道炎癥的影響及其作用機制

  更多相關(guān)文章： TDI 哮喘 E-cadhein EP

【摘要】：研究背景及目的 支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥,以氣道非特異性炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑為主要特征。在全世界范圍內(nèi),約有3億人患哮喘,我國目前約有2700萬哮喘患者,據(jù)估計至2015年,將新增加1億哮喘患者。 職業(yè)性哮喘屬于支氣管哮喘的一種,是由于接觸工作環(huán)境中職業(yè)性致喘物后引起的氣道疾病。臨床表現(xiàn)為接觸職業(yè)致喘物后出現(xiàn)的發(fā)作性胸悶、氣短、喘息、哮鳴,常伴有咳嗽、咳痰等。近年來職業(yè)性哮喘發(fā)病人數(shù)有逐年增多的趨勢,這主要由于合成化學(xué)工業(yè)的迅猛發(fā)展,不但使接觸人數(shù)有所增加,同時也出現(xiàn)了前所未有的種類與數(shù)量極多的職業(yè)性變應(yīng)原或半抗原物質(zhì)。在工業(yè)環(huán)境里受到廣泛關(guān)注的是甲苯二異氰酸酯(Toluene Diisocyanate, TDI)。據(jù)統(tǒng)計,長期暴露于TDI環(huán)境的人群,約有5%-15%發(fā)展為哮喘,而全球普通人群的哮喘患病率約為0.1%-8%,我國約為0.11%-2.03%。隨著我國工業(yè)的發(fā)展,像TDI哮喘這樣一些職業(yè)性哮喘的患病率也在逐年增加。 TDI為無色透明至淡黃色液體,有刺激性氣味；遇光顏色變深,容易與包含有活潑氫原子的化合物：胺、水、醇、酸、堿發(fā)生反應(yīng)。目前主要用來生產(chǎn)軟質(zhì)聚氨酯泡沫及聚氨酯彈性體、涂料、膠黏劑等。TDI哮喘的臨床表現(xiàn)和病理變化與過敏性哮喘大致相同,但目前針對TDI哮喘的發(fā)病機制研究并不多,相關(guān)研究領(lǐng)域還比較局限,許多方面還不是很清楚。本實驗第一個目的將試圖建立一種可靠穩(wěn)定的職業(yè)性哮喘模型研究TDI哮喘的發(fā)病機制及治療措施。 既往研究證實哮喘是一種多基因的遺傳性疾病。然而自1980年以來,哮喘發(fā)病率上升了將近1倍。這一現(xiàn)象不能完全用基因改變來解釋,環(huán)境因素對基因易感人群的作用同樣不可忽視。流行病學(xué)調(diào)查確認(rèn)了許多哮喘的危險因素,如飲食中低抗氧化劑、吸煙、大氣污染(柴油顆粒、NOX和臭氧等)以及反復(fù)的呼吸道病毒感染。因此環(huán)境因素和基因因素是相互作用的,當(dāng)基因易感者的支氣管上皮細(xì)胞失去對環(huán)境致病因素的抵御作用時,在上皮細(xì)胞局部就產(chǎn)生損傷,破壞氣道上皮細(xì)胞屏障的完整性。支氣管上皮細(xì)胞屏障主要包括支氣管上皮細(xì)胞,及上皮細(xì)胞之間的連接裝置。上皮細(xì)胞之間的連接方式有三種：緊密連接、黏附連接和縫隙連接,其中較為重要的是緊密連接和黏附連接。緊密連接主要位上皮細(xì)胞間隙腔面之頂端部,是細(xì)胞間最基本、最常見的組織結(jié)構(gòu)形式。緊密連接分子由閉鎖蛋白,緊密連接蛋白和連接黏附分子3種膜蛋白和閉合小環(huán)蛋白(ZO-1、Z0-2和ZO-3)等外周胞漿蛋白組成。緊密連接蛋白是緊密連接的骨架蛋白,并參與細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。黏附連接由黏附蛋白如E-cadherin和a-連環(huán)蛋白、J-3連環(huán)蛋白、Y-連環(huán)蛋白組成的復(fù)合體。氣道上皮細(xì)胞屏障破壞后可以通過釋放各種介質(zhì)在哮喘炎癥的啟動和維持中發(fā)揮重要作用。其中氣道上皮粘附連接分子E-cadherin的作用備受關(guān)注。首先是它作為上皮屏障的一種連接蛋白,它可以調(diào)節(jié)緊密連接蛋白,如ZO-1, ocludin, claudin-2等緊密連接蛋白的生成與分布,而且還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)E-cadherin可以抑制NF-kB的活性, NF-kB是哮喘氣道炎癥的募集關(guān)鍵信號通路：此外,氣道上皮細(xì)胞干擾E-cadherin后,可以促進(jìn)Th2細(xì)胞募集因子TRAC及促炎因子TSLP的表達(dá),進(jìn)一步有學(xué)者發(fā)現(xiàn),上皮細(xì)胞連分子E-cadhein決定了上皮免疫耐受表型或者促炎表型。來自于纖維支氣管鏡活檢獲得的臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn),E-cadherin在哮喘病人支氣管上皮表達(dá)降低,且其降低的程度與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),TDI哮喘小鼠的氣道上皮連接分子E-cadhein排列紊亂,提示E-cadherin參與了TDI哮喘的發(fā)病過程。保護(hù)氣道上皮連接分子E-cadhein將為TDI哮喘的治療提供一個方向。 丙酮酸乙酯(EP)是一種安全、穩(wěn)定的脂溶性丙酮酸衍生物,在多種疾病動物模型中有抗炎抗氧化等器官保護(hù)作用,然而EP是如何發(fā)揮抗炎作用的目前尚不完全清楚。最近,有學(xué)者發(fā)現(xiàn),EP可以通過保護(hù)腸連接蛋白ZO-1, occludin來改善LPS誘導(dǎo)的腸上皮損傷,提示EP可以通過減少緊密連接分子的破壞來減少腸上皮的損傷。但EP是否能保護(hù)氣道上皮連接分子E-cadherin以及抑制TDI哮喘氣道炎癥目前尚無報道。因此,本實驗的第二個目的將探討EP是否可以減少氣道上皮連接分子E-cadherin的破壞來抑制TDI哮喘氣道炎癥。 研究內(nèi)容 第一部分：參考國外研究者的建立模型方法建立TDI誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型 第二部分：在此模型的基礎(chǔ)之上給予EP干預(yù)(腹腔注射),觀察氣道上皮連接分子E-cadherin的表達(dá)變化。 第三部分：在此模型的基礎(chǔ)之上給予EP干預(yù)(腹腔注射),觀察哮喘炎癥變化情況。 材料與方法 SPF級雄性BALB/c小鼠45只6-8周齡,體重為20±2g(購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心),隨機分為3組：(1)對照組(A00組,A00為丙酮+橄欖油,是TDI的溶劑)；(2)實驗組(TDI組)；(3) TDI+EP干預(yù)組(EP組)。AS-D試劑盒、丙酮、橄欖油、TDI(sigma); IgE(ALPCO);小鼠白細(xì)胞介素-4(IL-4)γ-干擾素(IFN-γ), IL-1β TNF-a試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；MPO試劑盒、HE染液,PAS染液(南京建成)。E-cadherin一抗(santa cruz)。 HMGB1一抗(Abcam),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)。 1.動物模型的制備 BALB/c小鼠在南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級條件下飼養(yǎng)。A00組：第1天、第8天致敏。具體方法：將丙酮和橄欖油的混合液(體積比為2：3)20微升滴到小鼠耳背部,40微升／只小鼠；第15天,第18天,第21天給予霧化吸入激發(fā)。具體方法：將小鼠放進(jìn)霧化箱,用槍將丙酮橄欖油混合液(體積比為1：4)放進(jìn)霧化裝置,持續(xù)霧化2小時。每次激發(fā)前1h按100mg/kg劑量腹腔注射生理鹽水。TDI組：第1天,第8天致敏。具體方法：0.3%TDI20微升(丙酮和橄欖油體積比為2：3)滴到小鼠耳背部,40微升/只小鼠；第15天,第18天,第21天給予霧化吸入激發(fā),具體方法：將小鼠放進(jìn)霧化箱,用槍將3%TDI(丙酮和橄欖油體積比為1：4)放進(jìn)霧化裝置,持續(xù)霧化2小時。每次激發(fā)前1h按100mg/kg劑量腹腔注射生理鹽水。EP組操作過程同TDI組,每次激發(fā)前1h按100mg/kg劑量腹腔注射EP。 2.氣道高反應(yīng)性檢測 小鼠氣道高反應(yīng)性于第3次激發(fā)后24h檢測,乙酰甲膽堿依次由低濃度開始激發(fā)(濃度分別為0、3.12、6.25、12.5、25mg/ml),每個濃度霧化后檢測2min,觀察小鼠反應(yīng),BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀記錄小鼠氣道反應(yīng)性監(jiān)測指標(biāo)(Penh enhanced pause)。 3.取血 測量小鼠肺功能結(jié)束后24h,麻醉小鼠,給予小鼠眼球摘除,取血,將全血放置1h后,3000轉(zhuǎn)/分,離心20分鐘,取上清,-80℃保存?zhèn)溆�。按照說明書測血清IgE的含量. 4.淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 將A00組、TDI組小鼠耳后淋巴結(jié)分別放入1.5mlEP管,所有EP管均置于冰上,加入1.0mlPBS.摘取淋巴結(jié)結(jié)束后,將EP管中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移至100目濾網(wǎng)上,眼科鑷輕輕擠壓,10mlRPMI-1640沖洗,15m1離心管收集沖洗液,10微升沖洗液計數(shù)細(xì)胞,剩余沖洗液1000轉(zhuǎn)/分,離心3分鐘,倒掉上清液,用RPMI重懸至細(xì)胞濃度為107/ml,準(zhǔn)備48孔板,每孔加入900微升RPMI-1640(10%FBS,5.0mg/1刀豆素蛋白A),將100微升的細(xì)胞懸液加入其中使得細(xì)胞濃度為106/ml。37℃培養(yǎng)40小時。培養(yǎng)結(jié)束后取培養(yǎng)液1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,上清分裝-80℃保存待測。 5.支氣管肺泡灌洗細(xì)胞分類計數(shù)及檢測IL-1β、TNF-α 淋巴結(jié)摘除完成后,氣管切開,留置針置入,縫線固定,0.8mlPBS灌洗,反復(fù)2次,回收率在80%左右,1200r/min離心10min,上清用于檢測IL-1β、TNF-a.離心沉淀細(xì)胞用0.2m1PBS重懸,取0.01m1在血細(xì)胞計數(shù)器下計算細(xì)胞總數(shù),其余沉渣細(xì)胞涂片經(jīng)HE染色,按細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分類計數(shù)(至少計數(shù)200個細(xì)胞)。 6.肺組織病理學(xué)觀察 肺泡灌洗完成后,迅速取左肺10%多聚甲醛灌注固定24h,經(jīng)脫水,透明,石蠟包埋,切片后行HE染色、PAS染色及AS-D染色,光鏡下光鏡觀察支氣管粘膜炎性細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞增生情況等病理改變以及上皮細(xì)胞基底膜中性粒細(xì)胞浸潤情況。 7.免疫組化及蛋白印跡 按照免疫組化染色試劑盒說明操作,一抗為濃縮型兔多克隆親和純化E-cadherin抗體以及兔多克隆親和純化HMGB1抗體(稀釋度1：100).陽性細(xì)胞著色表現(xiàn)為染成棕褐色。提取右肺組織蛋白,變性,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜2h,5%脫脂奶粉封閉2h, E-cadhein一抗4℃過夜,抗兔熒光二抗常溫孵育1h, Odyssey(?) CLx顯影。 8.肺組織MPO活性檢測 按照MPO試劑盒說明書操作,檢測肺組織中MPO的活性。 9.統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間總體均數(shù)比較在方差齊時采用單因素方差分析one-way ANOVA,方差不齊時用Welch校正檢驗,以p0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.EP對小鼠肺功能的影響 隨著乙酰膽堿濃度上升各組小鼠氣道反應(yīng)性檢測指標(biāo)%基線Penh值均出現(xiàn)上升趨勢,TDI組小鼠的氣道反應(yīng)性最高。乙酰膽堿濃度為3.12、6.25、12.5、25mg/ml時,TDI組小鼠氣道反應(yīng)性比對照組高(P0.05)；乙酰膽堿濃度為6.25、12.5、25.0mg/ml時,100mg/kg組顯著降低小鼠氣道反應(yīng)性(P0.05)。 2.EP對小鼠肺泡灌洗液ELISA法檢測IL-4,淋巴結(jié)上清檢測IgE.IFN-γ的作用 三次激發(fā)之后,TDI組Thl炎癥因子IFN-γ、Th2炎癥因子IL-4及血清IgE均高于A00組(167.92±7.56pg、ml vs37.47±5.27pg/ml:272.66±4.79pg/ml vs20.48±2.18pg/ml:431.78±16.205pg/ml vs331.26±0.4119pg/ml),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),腹腔注射100mg/kg EP能夠減少IFN-γ、IL-4及IgE的釋放,與TDI組有統(tǒng)計學(xué)差異(92.11±4.91pg/ml vs167.92±7.56pg/ml:170.63±4.05pg/ml vs272.66±4.79pg/ml:345.67±2.21vs431.78±16.21pg/ml)(P0.05). 3.EP對小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞的作用 三次激發(fā)之后,TDI哮喘組肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)顯著增高,與A00組比較,差異顯著(P0.05).100mg/kg EP干預(yù)組肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)目較TDI組減少(P0.05),但仍高于A00組。 4.EP對HMGB1、IL-1β、TNF-a及MPO的作用 三次激發(fā)后,TDI組HMGB1、IL-1β及MPO的水平較AOO組顯著增高(IL-1β:27.7±2.8443pg/ml vs5.4833±0.7855pg/ml:MPO:4.7567±0.5767u/g vs2.09±0.3179u/g)(P0.05),EP100mg/kg干預(yù)后,能減少HMGB1、IL-1β及MPO的釋放(IL-1β:2.9714±0.9255pg/ml vs27.7±2.8443pg/ml:MPO:2.3967±0.1126l/g vs4.7567±0.5767u、g)(P0.05).TNF-a沒有檢測到。 5.EP對小鼠肺組織病理改變的作用 對照組：支氣管、肺泡、血管結(jié)構(gòu)正常完整,支氣管壁周圍無炎性細(xì)胞浸潤,支氣管上皮無增生分化,無脫落。TDI組：氣道上皮脫落,上皮細(xì)胞增生,粘液分泌增加,管壁周圍可見大量中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤。與TDI實驗組對比,100mg/kg EP干預(yù)之后氣道-血管壁周圍中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤減少,炎癥明顯減輕。氣道上皮增生分化明顯減弱。 6.EP對小鼠氣道上皮連接分子E-cadherin的影響 用免疫組化及蛋白印記檢測肺組織氣道上皮連接分子E-cadherin的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示A00組小鼠氣道上皮細(xì)胞連接分子E-cadherin呈棕黃色,表達(dá)在細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接處,細(xì)胞漿極少表達(dá)。TDI哮喘組小鼠氣道上皮增生,E-cadherin表達(dá)減少,排列混亂,上皮細(xì)胞漿可見部分棕黃色。100mg/kgEP干預(yù)后,氣道上皮細(xì)胞增生減弱,E-cadherin破壞減少,排列部分恢復(fù)正常。蛋白印記結(jié)果也顯示TDI哮喘組小鼠的氣道上皮連接分子E-cadherin表大量減少,100mg/kg EP干預(yù)后能部分恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)量。 結(jié)論： 1：我們成功的建立TDI誘導(dǎo)的哮喘模型 2：EP可以改善TDI哮喘小鼠支氣管上皮連接分子E-cadherin的破壞 3：給予EP干預(yù)對TDI哮喘氣道炎癥具有抑制作用,有可能是通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)發(fā)揮抑制炎癥作用的。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 楊錫強;小兒哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機制及其對策[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2001年05期

2 潘雷,王英華,曾錦旗;核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué);2002年04期

3 劉亞君,陳良安,代華平,張波;中華醫(yī)學(xué)會第六次全國呼吸系病學(xué)術(shù)會議紀(jì)要[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2001年01期

，

本文編號：1151171