本文關鍵詞：TRAIL及其信號傳遞途徑在特發(fā)性肺纖維化形成中作用的研究

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【摘要】：研究背景 特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種原因不明的彌漫性肺間質疾病，主要表現(xiàn)為肺部炎癥、肺泡持續(xù)性損傷及細胞外基質過度沉積。IPF的臨床表現(xiàn)為活動性呼吸困難、常規(guī)X線胸片或HRCT顯示雙下肺和胸膜下分布為主的網(wǎng)狀改變或伴蜂窩肺、限制性通氣障礙、彌散功能降低和低氧血癥。IPF確診后平均生存期僅為3-5年，其確切的發(fā)病機制尚未完全闡明，缺乏有效特異的治療手段來阻止或逆轉肺纖維化。目前，IPF發(fā)病機制的研究仍為國內外研究的熱點和難點。近年來，一些學者發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing factor,TRAIL）在急慢性氣道炎癥中起著非常重要的作用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)在鼻病毒誘導的氣道炎癥模型中，TRAIL調控MID1表達增加，MID1通過與PP2A催化亞基α4結合降低PP2A活性促進炎癥因子在氣道結構重塑中發(fā)揮作用，而TRAIL及其信號傳遞途徑與肺纖維化形成的關系及機制尚未明了。 目的 通過體內、外實驗首次明確TRAIL促進肺纖維化的形成，并闡述其調節(jié)下游信號傳遞途徑的機制；探討PP2A激活劑對肺纖維化形成過程的干預作用，為IPF的臨床診斷及治療提供了新的思路和方向。 方法 ⑴對TRAIL基因敲除及其同源野生型小鼠進行一次性氣管內灌注博萊霉素建立肺纖維化模型。應用Pulmonary Maneuvers PFT肺功能檢測系統(tǒng)對小鼠進行肺功能檢測，觀察病理切片不同時期肺泡炎、肺纖維化程度的變化、計算機纖維化程度評分及qPCR法檢測collagen α2(I)在mRNA水平上的表達判定肺纖維化程度，采用TUNEL染色檢測細胞凋亡情況，ELISA法檢測TRAIL在蛋白水平的表達，從而明確TRAIL對小鼠肺纖維化的促進作用。 ⑵建立小鼠肺纖維化模型，采用qPCR法檢測MID-1及相關細胞因子TGF-β、MCP1、MMP9在mRNA水平上的表達情況，應用ELISA法檢測PP2A磷酸化活性，從而明確TRAIL調節(jié)下游的信號傳遞途徑的機制。 ⑶建立小鼠肺纖維化模型的基礎上，同時外源性給予小鼠鼻內滴注AALs（PP2A激活劑）來干預博萊霉素所致的肺纖維化過程，分別使用了一次性AALs預處理（建模前1天給藥）及持續(xù)性給AALs（建模當天給藥并持續(xù)給藥）兩種干預方式，對小鼠進行肺功能檢測，觀察建模及給藥后小鼠肺組織病理切片肺泡炎癥情況、肺纖維化程度的變化、計算機纖維化程度評分及qPCR法檢測collagenα2(I)在mRNA水平上的表達判定肺纖維化程度，并應用ELISA法檢測PP2A磷酸化活性，評估PP2A激活劑對小鼠肺纖維化模型的影響。 ⑷從小鼠肺組織中分離原代肺成纖維細胞做體外原代細胞培養(yǎng)并傳代，采用MTT法檢測rTRAIL及AALs對其增殖的影響；實時熒光定量PCR檢測成纖維細胞中MID-1、TGF-β及collagen α2(I)在mRNA水平上的表達情況。 ⑸收集IPF患者的臨床資料、血清及肺活檢組織，ELISA檢測血清中TRAIL，肺組織中MID1、PP2A活性在蛋白水平上的表達情況。采用Pearson相關系數(shù)分析TRAIL及MID1與肺功能之間的相關性。 結果 ⑴建模后第1天TUNEL染色顯示肺組織中凋亡細胞明顯增多（P0.05）；建模后第4天TUNEL染色顯示肺組織中凋亡細胞數(shù)量減少（P0.05）；建模后第8天HE染色示肺組織中上皮細胞損傷、局部出血水腫明顯，肺泡間隔和肺泡腔內大量炎細胞浸潤，Masson染色可見少量膠原纖維被染成藍色；建模后第21天Masson染色顯示炎細胞浸潤也較明顯，纖維組織增生顯著，局部呈條索瘢痕改變，部分肺泡結構消失。 ⑵根據(jù)計算機肺纖維化評分及collagen α2(I)mRNA表達情況，博萊霉素模型組（WT BLM）較正常對照組有明顯的纖維化（P0.01），小鼠最大順應性、肺活量較正常對照組顯著降低（P0.01），而TRAIL敲除（TKO BLM）小鼠肺纖維化程度減輕，肺功能明顯改善（P0.05），與正常對照組沒有顯著性差異。 ⑶小鼠肺纖維化模型中，模型組較正常對照組肺組織中MID1及相關因子（TGF-β、MCP1、MMP9）在mRNA水平上表達增加（P0.05）；敲除TRAIL基因的小鼠肺組織中上述因子在mRNA水平表達下降。相反，模型組較正常對照組肺組織中PP2A磷酸化活性降低（P0.05）；敲除TRAIL基因的小鼠肺組織中PP2A磷酸化活性增高，差異具有統(tǒng)計學意義。 ⑷一次性藥物干預組（WT BLMAALs（-1））與模型組纖維化程度一致，而持續(xù)藥物干預組（WT BLM AALs）較模型組纖維化程度顯著減輕（P0.001），說明持續(xù)藥物干預可改善小鼠肺功能，促炎因子TGF-β、MCP1、MMP9表達顯著降低，說明AALs（PP2A激活劑）可減少炎癥因子釋放、干預纖維化形成。 ⑸低濃度rTRAIL可刺激成纖維細胞增殖，當其濃度為1ng/ml時，細胞增殖最為顯著（P0.001），collagen α2(I)表達也顯著增加（P0.01）；而在此基礎上同時給予1uMAALs（PP2A激活劑）,collagen α2(I)表達反而下降（P0.001）。 ⑹IPF患者血清中TRAIL表達顯著升高（P0.001），肺組織中MID1蛋白表達明顯升高（P0.05），PP2A活性顯著降低（P0.001）。IPF患者血清TRAIL表達水平與肺組織中MID1蛋白表達水平呈正相關(r2=0.8717,P=0.0007,n=8)，IPF患者血清中TRAIL表達水平與肺彌散功能（DLco）(r2=0.7528,P0.0001,n=14)及殘氣容積（RV）(r2=0.7268,P=0.0001,n=14)呈負相關；IPF患者肺組織中MID1表達水平與DLco(r2=0.8903,P=0.0004,n=8)及RV(r2=0.7561,P=0.005,n=8)呈負相關。 結論 ⑴TRAIL促進小鼠肺纖維化的形成，通過調節(jié)MID1表達增加，降低PP2A磷酸化活性，從而促進相關因子TGF-β、MCP1、MMP9的表達，最終導致肺纖維化形成。敲除小鼠TRAIL基因或持續(xù)給予小鼠PP2A激活劑，可緩解肺纖維化程度，干預肺纖維化形成，同時改善肺功能。該研究首次探討了TRAIL能夠促進肺纖維化的形成，不僅完善了肺纖維化的發(fā)病機制，同時也為我們臨床治療肺纖維化提供了新的治療靶點。 ⑵低濃度的rTRAIL促進了小鼠肺原代成纖維細胞的增殖，而PP2A激活劑在一定程度上干預了肺原代成纖維細胞膠原蛋白的表達。 ⑶TRAIL及其信號傳遞途徑參與IPF的形成，，血清中TRAIL蛋白表達含量可作為IPF輔助診斷的一種新方法，也可以作為IPF病變程度的衡量標準之一。
【關鍵詞】：特發(fā)性肺纖維化 TRAIL MID1 PP2A 氣道重塑
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 前言4-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-16
• 英文縮寫詞表16-18
• 第一章 綜述18-32
• 1.1 TRAIL 的文獻綜述18-23
• 1.1.1 TRAIL結構與功能18-19
• 1.1.2 TRAIL/TRAILR作用的途徑19-20
• 1.1.3 TRAIL在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用20-23
• 1.2 本實驗研究背景23-32
• 1.2.1 特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機制的研究進展23-28
• 1.2.2 特發(fā)性肺纖維化增加肺癌發(fā)病危險性的機制研究進展28-29
• 1.2.3 TRAIL及其下游信號通路 MID1、PP2A 與肺纖維化的關系29-32
• 第二章 TRAIL 及其信號傳遞途徑在博萊霉素誘導的 BALB/C 小鼠肺纖維化模型中的作用研究32-62
• 2.1 實驗材料32-33
• 2.1.1 主要試劑32-33
• 2.1.2 主要實驗儀器33
• 2.1.3 實驗動物33
• 2.2 實驗方法33-43
• 2.2.1 小鼠肺纖維化模型的建立及給藥33-35
• 2.2.2 小鼠肺功能檢測35-36
• 2.2.3 HE染色方法36-37
• 2.2.4 Masson三色染色方法37
• 2.2.5 TUNEL染色方法37-38
• 2.2.6 博萊霉素誘導小鼠模型肺間質病變評定方法38-39
• 2.2.7 mRNA表達水平的檢測39-41
• 2.2.8 目標因子蛋白水平檢測41-43
• 2.2.9 統(tǒng)計學分析43
• 2.3 實驗結果43-57
• 2.3.1 博萊霉素誘導 BALB/c 小鼠肺纖維化模型的建立（實驗設計一，見實驗方法）43-47
• 2.3.2 TRAIL及其信號傳遞途徑參與博萊霉素誘導的 BALB/c 小鼠肺纖維化的形成（實驗設計二）47-55
• 2.3.3 PP2A激活劑（AALs）對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠的影響55-57
• 2.4 討論57-62
• 第三章 RTRAIL 及 AALS 對 BALB/C 小鼠原代肺成纖維細胞增殖影響的研究62-70
• 3.1 實驗材料62-63
• 3.1.1 實驗動物62
• 3.1.2 藥品及試劑62
• 3.1.3 主要儀器62-63
• 3.2 實驗方法63-67
• 3.2.1 小鼠原代肺成纖維細胞的培養(yǎng)63-64
• 3.2.2 MTT法檢測細胞增殖情況64-65
• 3.2.3 mRNA表達水平的檢測65-67
• 3.3 實驗結果67-69
• 3.3.1 rTRAIL與 AAL 對小鼠肺原代成纖維細胞增殖的影響67-68
• 3.3.2 rTRAIL及 AALs 對小鼠肺原代成纖維細胞在 mRNA 水平上的影響68-69
• 3.4 討論69-70
• 第四章 TRAIL 及其信號傳遞途徑在 IPF 患者肺纖維化形成中作用的研究70-78
• 4.1 實驗材料70-71
• 4.1.1 主要試劑70-71
• 4.1.2 標本來源71
• 4.2 實驗方法71-73
• 4.2.1 目標因子蛋白水平檢測71-73
• 4.2.2 統(tǒng)計學分析73
• 4.3 實驗結果73-76
• 4.3.1 IPF患者與正常對照組一般資料的特點73-74
• 4.3.2 IPF患者血清中 TRAIL 表達情況及其與肺功能的關系74-75
• 4.3.3 IPF患者肺組織中 MID1 表達情況及其與肺功能的關系75
• 4.3.4 IPF患者血清 TRAIL 與肺組織中 MID1 的相關性75-76
• 4.3.5 IPF患者肺組織中 PP2Ac 總蛋白含量及 PP2A 磷酸化活性表達情況76
• 4.4 討論76-78
• 第五章 結論78-80
• 參考文獻80-88
• 作者簡介88-90
• 攻讀博士期間發(fā)表的學術論文及其他成果文章90-92
• 致謝92

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉磊;方艷秋;許淑芬;譚巖;;重組可溶性TRAIL的表達及其誘導A549和H460~(wt)細胞凋亡[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2008年02期

2 魏路清 ,董彥;肺纖維化發(fā)病機制及治療策略的新觀念[J];國外醫(yī)學(呼吸系統(tǒng)分冊);2003年01期

3 李曰玉;劉景艷;;腫瘤壞死因子-a在肺間質纖維化發(fā)病機制中的作用[J];社區(qū)醫(yī)學雜志;2007年11期

本文編號：1091072