本文關(guān)鍵詞：TRAIL及其信號(hào)傳遞途徑在特發(fā)性肺纖維化形成中作用的研究

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【摘要】：研究背景 特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種原因不明的彌漫性肺間質(zhì)疾病，主要表現(xiàn)為肺部炎癥、肺泡持續(xù)性損傷及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。IPF的臨床表現(xiàn)為活動(dòng)性呼吸困難、常規(guī)X線胸片或HRCT顯示雙下肺和胸膜下分布為主的網(wǎng)狀改變或伴蜂窩肺、限制性通氣障礙、彌散功能降低和低氧血癥。IPF確診后平均生存期僅為3-5年，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，缺乏有效特異的治療手段來(lái)阻止或逆轉(zhuǎn)肺纖維化。目前，IPF發(fā)病機(jī)制的研究仍為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing factor,TRAIL）在急慢性氣道炎癥中起著非常重要的作用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)在鼻病毒誘導(dǎo)的氣道炎癥模型中，TRAIL調(diào)控MID1表達(dá)增加，MID1通過(guò)與PP2A催化亞基α4結(jié)合降低PP2A活性促進(jìn)炎癥因子在氣道結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮作用，而TRAIL及其信號(hào)傳遞途徑與肺纖維化形成的關(guān)系及機(jī)制尚未明了。 目的 通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)首次明確TRAIL促進(jìn)肺纖維化的形成，并闡述其調(diào)節(jié)下游信號(hào)傳遞途徑的機(jī)制；探討PP2A激活劑對(duì)肺纖維化形成過(guò)程的干預(yù)作用，為IPF的臨床診斷及治療提供了新的思路和方向。 方法 ⑴對(duì)TRAIL基因敲除及其同源野生型小鼠進(jìn)行一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉素建立肺纖維化模型。應(yīng)用Pulmonary Maneuvers PFT肺功能檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行肺功能檢測(cè)，觀察病理切片不同時(shí)期肺泡炎、肺纖維化程度的變化、計(jì)算機(jī)纖維化程度評(píng)分及qPCR法檢測(cè)collagen α2(I)在mRNA水平上的表達(dá)判定肺纖維化程度，采用TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，ELISA法檢測(cè)TRAIL在蛋白水平的表達(dá)，從而明確TRAIL對(duì)小鼠肺纖維化的促進(jìn)作用。 ⑵建立小鼠肺纖維化模型，采用qPCR法檢測(cè)MID-1及相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、MCP1、MMP9在mRNA水平上的表達(dá)情況，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)PP2A磷酸化活性，從而明確TRAIL調(diào)節(jié)下游的信號(hào)傳遞途徑的機(jī)制。 ⑶建立小鼠肺纖維化模型的基礎(chǔ)上，同時(shí)外源性給予小鼠鼻內(nèi)滴注AALs（PP2A激活劑）來(lái)干預(yù)博萊霉素所致的肺纖維化過(guò)程，分別使用了一次性AALs預(yù)處理（建模前1天給藥）及持續(xù)性給AALs（建模當(dāng)天給藥并持續(xù)給藥）兩種干預(yù)方式，對(duì)小鼠進(jìn)行肺功能檢測(cè)，觀察建模及給藥后小鼠肺組織病理切片肺泡炎癥情況、肺纖維化程度的變化、計(jì)算機(jī)纖維化程度評(píng)分及qPCR法檢測(cè)collagenα2(I)在mRNA水平上的表達(dá)判定肺纖維化程度，并應(yīng)用ELISA法檢測(cè)PP2A磷酸化活性，評(píng)估PP2A激活劑對(duì)小鼠肺纖維化模型的影響。 ⑷從小鼠肺組織中分離原代肺成纖維細(xì)胞做體外原代細(xì)胞培養(yǎng)并傳代，采用MTT法檢測(cè)rTRAIL及AALs對(duì)其增殖的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)成纖維細(xì)胞中MID-1、TGF-β及collagen α2(I)在mRNA水平上的表達(dá)情況。 ⑸收集IPF患者的臨床資料、血清及肺活檢組織，ELISA檢測(cè)血清中TRAIL，肺組織中MID1、PP2A活性在蛋白水平上的表達(dá)情況。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析TRAIL及MID1與肺功能之間的相關(guān)性。 結(jié)果 ⑴建模后第1天TUNEL染色顯示肺組織中凋亡細(xì)胞明顯增多（P0.05）；建模后第4天TUNEL染色顯示肺組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量減少（P0.05）；建模后第8天HE染色示肺組織中上皮細(xì)胞損傷、局部出血水腫明顯，肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，Masson染色可見(jiàn)少量膠原纖維被染成藍(lán)色；建模后第21天Masson染色顯示炎細(xì)胞浸潤(rùn)也較明顯，纖維組織增生顯著，局部呈條索瘢痕改變，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失。 ⑵根據(jù)計(jì)算機(jī)肺纖維化評(píng)分及collagen α2(I)mRNA表達(dá)情況，博萊霉素模型組（WT BLM）較正常對(duì)照組有明顯的纖維化（P0.01），小鼠最大順應(yīng)性、肺活量較正常對(duì)照組顯著降低（P0.01），而TRAIL敲除（TKO BLM）小鼠肺纖維化程度減輕，肺功能明顯改善（P0.05），與正常對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異。 ⑶小鼠肺纖維化模型中，模型組較正常對(duì)照組肺組織中MID1及相關(guān)因子（TGF-β、MCP1、MMP9）在mRNA水平上表達(dá)增加（P0.05）；敲除TRAIL基因的小鼠肺組織中上述因子在mRNA水平表達(dá)下降。相反，模型組較正常對(duì)照組肺組織中PP2A磷酸化活性降低（P0.05）；敲除TRAIL基因的小鼠肺組織中PP2A磷酸化活性增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ⑷一次性藥物干預(yù)組（WT BLMAALs（-1））與模型組纖維化程度一致，而持續(xù)藥物干預(yù)組（WT BLM AALs）較模型組纖維化程度顯著減輕（P0.001），說(shuō)明持續(xù)藥物干預(yù)可改善小鼠肺功能，促炎因子TGF-β、MCP1、MMP9表達(dá)顯著降低，說(shuō)明AALs（PP2A激活劑）可減少炎癥因子釋放、干預(yù)纖維化形成。 ⑸低濃度rTRAIL可刺激成纖維細(xì)胞增殖，當(dāng)其濃度為1ng/ml時(shí)，細(xì)胞增殖最為顯著（P0.001），collagen α2(I)表達(dá)也顯著增加（P0.01）；而在此基礎(chǔ)上同時(shí)給予1uMAALs（PP2A激活劑）,collagen α2(I)表達(dá)反而下降（P0.001）。 ⑹IPF患者血清中TRAIL表達(dá)顯著升高（P0.001），肺組織中MID1蛋白表達(dá)明顯升高（P0.05），PP2A活性顯著降低（P0.001）。IPF患者血清TRAIL表達(dá)水平與肺組織中MID1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r2=0.8717,P=0.0007,n=8)，IPF患者血清中TRAIL表達(dá)水平與肺彌散功能（DLco）(r2=0.7528,P0.0001,n=14)及殘氣容積（RV）(r2=0.7268,P=0.0001,n=14)呈負(fù)相關(guān)；IPF患者肺組織中MID1表達(dá)水平與DLco(r2=0.8903,P=0.0004,n=8)及RV(r2=0.7561,P=0.005,n=8)呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論 ⑴TRAIL促進(jìn)小鼠肺纖維化的形成，通過(guò)調(diào)節(jié)MID1表達(dá)增加，降低PP2A磷酸化活性，從而促進(jìn)相關(guān)因子TGF-β、MCP1、MMP9的表達(dá)，最終導(dǎo)致肺纖維化形成。敲除小鼠TRAIL基因或持續(xù)給予小鼠PP2A激活劑，可緩解肺纖維化程度，干預(yù)肺纖維化形成，同時(shí)改善肺功能。該研究首次探討了TRAIL能夠促進(jìn)肺纖維化的形成，不僅完善了肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也為我們臨床治療肺纖維化提供了新的治療靶點(diǎn)。 ⑵低濃度的rTRAIL促進(jìn)了小鼠肺原代成纖維細(xì)胞的增殖，而PP2A激活劑在一定程度上干預(yù)了肺原代成纖維細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)。 ⑶TRAIL及其信號(hào)傳遞途徑參與IPF的形成，，血清中TRAIL蛋白表達(dá)含量可作為IPF輔助診斷的一種新方法，也可以作為IPF病變程度的衡量標(biāo)準(zhǔn)之一。
【關(guān)鍵詞】：特發(fā)性肺纖維化 TRAIL MID1 PP2A 氣道重塑
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 前言4-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-16
• 英文縮寫(xiě)詞表16-18
• 第一章 綜述18-32
• 1.1 TRAIL 的文獻(xiàn)綜述18-23
• 1.1.1 TRAIL結(jié)構(gòu)與功能18-19
• 1.1.2 TRAIL/TRAILR作用的途徑19-20
• 1.1.3 TRAIL在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用20-23
• 1.2 本實(shí)驗(yàn)研究背景23-32
• 1.2.1 特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展23-28
• 1.2.2 特發(fā)性肺纖維化增加肺癌發(fā)病危險(xiǎn)性的機(jī)制研究進(jìn)展28-29
• 1.2.3 TRAIL及其下游信號(hào)通路 MID1、PP2A 與肺纖維化的關(guān)系29-32
• 第二章 TRAIL 及其信號(hào)傳遞途徑在博萊霉素誘導(dǎo)的 BALB/C 小鼠肺纖維化模型中的作用研究32-62
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料32-33
• 2.1.1 主要試劑32-33
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器33
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法33-43
• 2.2.1 小鼠肺纖維化模型的建立及給藥33-35
• 2.2.2 小鼠肺功能檢測(cè)35-36
• 2.2.3 HE染色方法36-37
• 2.2.4 Masson三色染色方法37
• 2.2.5 TUNEL染色方法37-38
• 2.2.6 博萊霉素誘導(dǎo)小鼠模型肺間質(zhì)病變?cè)u(píng)定方法38-39
• 2.2.7 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)39-41
• 2.2.8 目標(biāo)因子蛋白水平檢測(cè)41-43
• 2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析43
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-57
• 2.3.1 博萊霉素誘導(dǎo) BALB/c 小鼠肺纖維化模型的建立（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法）43-47
• 2.3.2 TRAIL及其信號(hào)傳遞途徑參與博萊霉素誘導(dǎo)的 BALB/c 小鼠肺纖維化的形成（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)二）47-55
• 2.3.3 PP2A激活劑（AALs）對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的影響55-57
• 2.4 討論57-62
• 第三章 RTRAIL 及 AALS 對(duì) BALB/C 小鼠原代肺成纖維細(xì)胞增殖影響的研究62-70
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料62-63
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物62
• 3.1.2 藥品及試劑62
• 3.1.3 主要儀器62-63
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法63-67
• 3.2.1 小鼠原代肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)63-64
• 3.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況64-65
• 3.2.3 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)65-67
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-69
• 3.3.1 rTRAIL與 AAL 對(duì)小鼠肺原代成纖維細(xì)胞增殖的影響67-68
• 3.3.2 rTRAIL及 AALs 對(duì)小鼠肺原代成纖維細(xì)胞在 mRNA 水平上的影響68-69
• 3.4 討論69-70
• 第四章 TRAIL 及其信號(hào)傳遞途徑在 IPF 患者肺纖維化形成中作用的研究70-78
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料70-71
• 4.1.1 主要試劑70-71
• 4.1.2 標(biāo)本來(lái)源71
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法71-73
• 4.2.1 目標(biāo)因子蛋白水平檢測(cè)71-73
• 4.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析73
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-76
• 4.3.1 IPF患者與正常對(duì)照組一般資料的特點(diǎn)73-74
• 4.3.2 IPF患者血清中 TRAIL 表達(dá)情況及其與肺功能的關(guān)系74-75
• 4.3.3 IPF患者肺組織中 MID1 表達(dá)情況及其與肺功能的關(guān)系75
• 4.3.4 IPF患者血清 TRAIL 與肺組織中 MID1 的相關(guān)性75-76
• 4.3.5 IPF患者肺組織中 PP2Ac 總蛋白含量及 PP2A 磷酸化活性表達(dá)情況76
• 4.4 討論76-78
• 第五章 結(jié)論78-80
• 參考文獻(xiàn)80-88
• 作者簡(jiǎn)介88-90
• 攻讀博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他成果文章90-92
• 致謝92

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 劉磊;方艷秋;許淑芬;譚巖;;重組可溶性TRAIL的表達(dá)及其誘導(dǎo)A549和H460~(wt)細(xì)胞凋亡[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

2 魏路清 ,董彥;肺纖維化發(fā)病機(jī)制及治療策略的新觀念[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(呼吸系統(tǒng)分冊(cè));2003年01期

3 李曰玉;劉景艷;;腫瘤壞死因子-a在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用[J];社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志;2007年11期

本文編號(hào)：1091072