本文關(guān)鍵詞：抑制EGFR-TGFβ正反饋環(huán)路緩解博來霉素致小鼠肺纖維化的研究

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【摘要】：研究背景和目的 間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)是可累及肺間質(zhì)、腺泡以及氣道的一組疾病,在終末細(xì)支氣管末端有各種細(xì)胞浸潤和胞外基質(zhì)的沉積,表現(xiàn)為肺泡-毛細(xì)血管功能單位的逐步喪失,最后進(jìn)展為彌漫的肺纖維化和蜂窩肺。間質(zhì)性肺疾病分為五大類,其中關(guān)于特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)的病理生理過程的研究是目前研究的熱點(diǎn),其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,現(xiàn)在仍缺乏特異有效的阻止或逆轉(zhuǎn)特發(fā)性肺纖維化的治療手段。 目前的研究中,公認(rèn)IPF發(fā)病機(jī)制為肺泡上皮細(xì)胞的損傷。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是肺纖維化重要的特征,上皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)失調(diào)是其關(guān)鍵的病理生理改變。氣道上皮細(xì)胞在纖維化的始動因素作用下向間充質(zhì)細(xì)胞(包括肌纖維母細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)轉(zhuǎn)分化,上皮細(xì)胞極性與細(xì)胞間連接、粘附結(jié)構(gòu)消失,細(xì)胞骨架重組,細(xì)胞器重新分布等間質(zhì)細(xì)胞樣改變,同時(shí)Ⅰ型膠原和纖維結(jié)合素合成增多,出現(xiàn)肌纖維母細(xì)胞的生物學(xué)行為成為肺間質(zhì)纖維化的細(xì)胞學(xué)變化基礎(chǔ)。目前對肺纖維化EMT的機(jī)制尚未完全了解,但最新的研究證實(shí)與EGFR/Akt、TGF-β/Smad等信號通路有關(guān)。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)為170kDa的跨膜糖蛋白,是原癌基因產(chǎn)物,廣泛存在于大多數(shù)上皮細(xì)胞和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞膜上,提供細(xì)胞生長、分化的信號,由其特定的配體表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子α (transforming growth factor α, TGF-α)活化。EGFR依賴于胞內(nèi)酪氨酸激酶的活化,刺激其下游的MAPK、Akt、JNK等信號通路,從而促進(jìn)DNA的合成及細(xì)胞的遷移、聚集和增殖。致炎、氧化損傷等因素的持續(xù)存在使EGFR過度活化是纖維化的一個(gè)重要因素,多個(gè)研究表明EGFR參與了纖維化EMT的過程。EGFR信號不僅促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,而且能夠延長已轉(zhuǎn)分化間質(zhì)細(xì)胞的壽命,最終加重纖維化程度。表皮生長因子家族及其受體在間質(zhì)性肺疾病發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用,是參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的重要因素。 轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor, TGF-β)是調(diào)控增殖、細(xì)胞分化和其他細(xì)胞功能重要因子,同時(shí)也是與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化密切相關(guān)的一個(gè)重要信號系統(tǒng),在組織器官纖維化中TGF-β主要是以依賴Smad的方式誘導(dǎo)EMT。有研究證實(shí)EGF能夠通過促進(jìn)增殖及E-鈣粘蛋白(E-cadherin, E-cad)的丟失,以抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT。另有研究表明,雖然TGF-β1不是EGFR配體,但仍可間接的激活EGFR并且使其磷酸化,使下游與EMT膠原蛋白合成的相關(guān)基因活化,促進(jìn)了成纖維細(xì)胞合成、分泌膠原蛋白與EMT。在肺纖維化過程中,是否存在著EGFR與TGF-β的相互作用,它們間是如何相互調(diào)控的? 本課題組的前期研究結(jié)果顯示,博來霉素(bleomycin, BLM)致肺纖維化小鼠模型肺組織中EGFR表達(dá)升高,小鼠肺組織病理損傷加重、纖維化評分?jǐn)?shù)值增高,同時(shí)伴有EGFR/Akt通路活化增加,TGF-β1的活化增加、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表達(dá)增多、羥脯氨酸含量明顯增加；用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)中和EGFR后,肺組織中EGFR濃度下降,小鼠肺組織病理損傷減輕、纖維化評分?jǐn)?shù)值降低,EGFR/Akt通路活化降低,TGF-β1的活化降低,α-SMA表達(dá)減少、羥脯氨酸含量明顯降低。為此,我們將繼續(xù)深入探討EGFR與TGF-β在纖維化進(jìn)程中的相互作用,闡明吉非替尼抑制博來霉素致肺纖維化進(jìn)程中上皮-基質(zhì)轉(zhuǎn)分化的機(jī)制,有助于發(fā)現(xiàn)肺纖維化的治療靶點(diǎn),而針對EGFR的調(diào)控有望成為緩解肺纖維化的一個(gè)新的治療策略。 為明確EGFR與TGF-β二者在肺纖維化EMT進(jìn)程中的相互關(guān)系,揭示肺纖維化過程中EMT的調(diào)節(jié)機(jī)制。本課題采用博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,檢測上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標(biāo)變化；運(yùn)用EGFR-TKI及TGF-β受體I抑制劑(transforming growth factor receptor I inhibitor, TGF-β RI inhibitor),探討抑制EGFR/Akt通路后博來霉素小鼠TGF-β/Smad通路活性的變化,抑制TGF-β/Smad后博來霉素小鼠EGFR/Akt通路活性的變化,闡明肺纖維化EMT中EGFR-TGFβ存在正反饋環(huán)路共同對EMT進(jìn)行調(diào)控。本研究闡明肺纖維化EMT的可能調(diào)控機(jī)制,將為尋找肺纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)、制定治療策略奠定良好基礎(chǔ)。 研究方法 1吉非替尼下調(diào)博來霉素致肺纖維化小鼠的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 小鼠隨機(jī)分為對照組(Control)、博來霉素組(BLM)、吉非替尼處理組(BLM+Ge)。BLM組氣道內(nèi)霧化BLM溶液(3mg/kg,100μL),對照組霧化等體積生理鹽水；BLM+Ge組小鼠霧化BLM后每天給予吉非替尼(20mg/kg,100μL)灌胃,對照組與BLM組予相同體積生理鹽水灌胃。第14天收集標(biāo)本。小鼠開胸取肺,將肺組織置于10%中性甲醛固定48小時(shí)后,石蠟包埋、切片行HE和Masson染色,參照Mikawar和Ashcroft法對肺病理損傷和纖維化程度進(jìn)行評分。肺組織勻漿后抽提總蛋白,Western blotting檢測α-SMA、 E-cadheru、Fibronectin蛋白表達(dá)水平。 2吉非替尼下調(diào)博來霉素致肺纖維化小鼠TGF-β通路活化 氣管內(nèi)霧化BLM溶液復(fù)制小鼠肺纖維化模型,小鼠分為對照組、BLM組、BLM+Ge組。BLM組與BLM+Ge組小鼠氣道內(nèi)霧化BLM溶液(3mg/kg,100μL),對照組霧化與BLM溶液等體積的生理鹽水。BLM+Ge組在BLM處理后予吉非替尼(20mg/kg/d,200μL)灌胃。14天后取樣,ELISA檢測血清TGF-p1水平,Western boltting檢測肺組織EGFR、Erk、Smad2/3蛋白表達(dá)及磷酸化水平。 3TGF-βRI抑制劑下調(diào)博來霉素致肺纖維化小鼠EGFR通路活化 氣管內(nèi)霧化BLM溶液復(fù)制小鼠肺纖維化模型,小鼠分為對照組、BLM組及TGF-βRI抑制劑處理組(BLM+Ly)。BLM組與BLM+Ly組小鼠氣道內(nèi)霧化BLM溶液(3mg/kg,100μL),對照組霧化與BLM溶液等體積的生理鹽水。BLM+Ly組在BLM處理后予TGF-βRI抑制劑(10mg/kg/d,200μL)灌胃。第14天收集標(biāo)本。小鼠開胸取肺,將肺組織置于10%中性甲醛固定48小時(shí)后,石蠟包埋、切片行HE和Masson染色,參照Mikawar5]和Ashcroft[16]法對肺病理損傷和纖維化程度進(jìn)行評分。ELISA檢測血清TGF-p1水平,Western Boltting檢測肺組織Smad2/3、c-Src、EGFR蛋白及磷酸化水平。 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齊時(shí)多重比較采用LSD檢驗(yàn)法,方差不齊時(shí)多重比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)法,顯著性水準(zhǔn)a取0.05,雙側(cè)。 結(jié)果 1吉非替尼下調(diào)博萊霉素致肺纖維化小鼠的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 1.1各組小鼠肺組織病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.750,P0.001)。對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤。BLM組小鼠各肺葉均存在彌漫性的肺泡間隔增厚與肺泡壁破壞,肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤與出血,血管床不同程度破壞。BLM+Ge組小鼠在肺泡結(jié)構(gòu)、血管床破壞程度和炎癥細(xì)胞浸潤方面均較輕。BLM組小鼠肺組織病理損傷評分顯著高于對照組(n=5,P0.001),吉非替尼處理后,小鼠病理損傷評分較BLM組明顯降低(n=5,P0.01)。 1.2各組小鼠肺組織纖維化評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.971,P0.001)。對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,未見明顯炎細(xì)胞浸潤、膠原沉積。BLM組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺間質(zhì)可見滲出、炎細(xì)胞浸潤,大量藍(lán)色膠原沉積。BLM+Ge組小鼠氣道上皮下出現(xiàn)少量炎細(xì)胞浸潤,肺泡間隔稍增厚,但結(jié)構(gòu)基本完整,少量藍(lán)色膠原沉積。BLM組小鼠肺組織纖維化評分顯著高于對照組(n=5,P0.001),吉非替尼處理后,小鼠纖維化評分較BLM組明顯降低(n=5,P0.01)。 1.3各組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.607,P0.001)。BLM組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平明顯增加(n=4,P0.001)；BLM+Ge組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平明顯降低(n=4,P=0.001)。 1.4各組小鼠肺組織α-SMA蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.581,P0.05)。BLM組小鼠肺組織α-SMA明顯增加(n=4,P0.01);BLM+Ge組小鼠肺組織a-SMA明顯降低(n=4,P0.05)。 1.5各組小鼠肺組織E-Cadherin蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.561, P0.01)。BLM組小鼠肺組織E-Cadherin明顯降低(n=4,P=0.001);BLM+Ge組小鼠肺組織E-Cadherin明顯增加(n=4,P=0.01)。 1.6各組小鼠肺組織Fibronectin蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.726,p0.001)。BLM組小鼠肺組織Fibronectin明顯增加(n=4,p0.001);BLM+Ge組小鼠肺組織Fibronectin明顯降低(n=4,P0.001)。 2吉非替尼下調(diào)博來霉素致肺纖維化小鼠TGF-p通路 2.1各組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.607,P0.001)。BLM組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平明顯增加(n=4,P0.001)；BLM+Ge組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平明顯降低(n=4,P=0.001夕。 2.2各組小鼠血清中TGF-β1濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.391,P=0.001)。BLM組小鼠肺組織TGF-β1明顯增加(n=5,P0.001)；BLM+Ge組小鼠肺組織TGF-β1明顯降低(n=5,P0.01)。 2.3各組小鼠肺組織Erk蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.78,P0.01)。BLM組小鼠肺組織Erk蛋白磷酸化水平明顯增加(n=4,P0.001)；BLM+Ge組小鼠肺組織Erk蛋白磷酸化水平明顯降低(n=4,P0.05)。 2.4各組小鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.7,P=0.001)。BLM組小鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平明顯增加(n=4,P0.001);BLM+Ge組小鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平明顯降低(n=4,P0.05)。 3TGF-p與EGFR/Akt兩通路在肺纖維化小鼠模型上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化間的相互作用 3.1各組小鼠肺組織病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=80.987,P0.001)。對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,無明顯充血及細(xì)胞浸潤。BLM組小鼠肺組織大面積實(shí)變,小鼠肺泡結(jié)構(gòu)亦大面積實(shí)變,肺泡間隔增厚,肺泡內(nèi)出血,炎細(xì)胞浸潤。BLM組小鼠肺組織病理損傷評分顯著高于對照組(n=4,P0.001),TGF-βRI抑制劑(Ly364947)處理后,小鼠病理損傷評分較BLM組增高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=4,P0.05)。 3.2各組小鼠肺組織纖維化評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.328,P0.001)。對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,未見明顯炎細(xì)胞浸潤、膠原沉積。BLM組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺間質(zhì)可見滲出、炎細(xì)胞浸潤,大量藍(lán)色膠原沉積。BLM+Ly組小鼠氣道上皮下出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增厚,基本肺泡結(jié)構(gòu)消失,大量藍(lán)色膠原沉積。BLM組小鼠肺組織纖維化評分顯著高于對照組(n=4,P0.001),TGF-βRI抑制劑處理后,小鼠纖維化評分較BLM組增高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=4,P0.05)。 3.3各組小鼠血清中TGF-β1濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.446, P0.05)。BLM組TGF-β1濃度較對照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=4, P0.001)。BLM+Ly組TGF-β1濃度均較模型組稍降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=4,P0.05)。 3.4各組小鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.351,P=0.001)。BLM組小鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平明顯增加(n=4, P0.001); BLM+Ly組小鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平明顯降低(n=4,P0.01)。 3.3各組小鼠肺組織c-Src蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.950,P0.001)。BLM組小鼠肺組織c-Src蛋白磷酸化水平明顯增加(n=4,P0.001)；BLM+Ly組小鼠肺組織c-Src蛋白磷酸化水平明顯降低(n=4,P0.001)。 3.5各組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.559,P0.001)。BLM組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平明顯增加(n=4,P0.001)；BLM+Ly組小鼠肺組織EGFR蛋白磷酸化水平明顯降低(n=4,P0.001)。 結(jié)論 1.下調(diào)EGFR活性,可抑制肺纖維化小鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。 2.吉非替尼抑制EGFR活化能夠抑制Erk活性,阻斷TGF-/βSmad通路活化,從而抑制肺纖維化EMT。 3.TGF-β信號可能通過活化c-Src從而激活EGFR通路,在博來霉素致小鼠肺纖維化中,EGFR和TGF-β/Smad通路存在正反饋環(huán)路,共同促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：肺纖維化 博來霉素 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 吉非替尼 TGF-βRI抑制劑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-22
• 第一章 吉非替尼抑制博來霉素致肺纖維化小鼠上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化22-40
• 1 材料23-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 3 結(jié)果31-37
• 4 討論37-40
• 第二章 吉非替尼下調(diào)博來霉素致肺纖維化小鼠TGF-β通路40-50
• 1 材料40-41
• 2 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 3 結(jié)果45-48
• 4 討論48-50
• 第三章 TGF-β RI抑制劑下調(diào)博來霉素致肺纖維化小鼠EGFR通路50-62
• 1 材料50-51
• 2 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 3 結(jié)果55-60
• 4 討論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 結(jié)論66-67
• 全文總結(jié)67-68
• 攻讀研究生學(xué)位期間成果68-69
• 縮略詞表69-70
• 致謝70-71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李理;李偉峰;蔡琳;袁偉鋒;黃文杰;;吉非替尼對博萊霉素致肺纖維化小鼠α平滑肌肌動蛋白的抑制作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年12期

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3 李偉峰;李理;袁偉鋒;黃文杰;;吉非替尼抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[J];中國病理生理雜志;2010年08期

4 李偉峰;李理;袁偉鋒;徐虹;黃文杰;;兩種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑對小鼠肺纖維化的干預(yù)作用比較[J];中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2010年04期

5 蔡后榮;;2011年特發(fā)性肺纖維化診斷和治療循證新指南解讀[J];中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2011年04期

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本文編號：1029564