本文關(guān)鍵詞：人支氣管上皮細胞GCLC基因調(diào)控區(qū)AP-2元件的研究

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【摘要】：背景 氧化應(yīng)激是許多急性或慢性肺部疾病的主要發(fā)病機制之一，嚴重危害了人類的健康。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是人體內(nèi)重要的保護性抗氧化物質(zhì)。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是體內(nèi)合成GSH的限速酶，其由催化亞單位(GCLC)和調(diào)節(jié)亞單位(GCLM)組成。GCLC含有γ-GCS所有底物的結(jié)合位點和所有的催化亞基，故具有γ-GCS所有的催化活性。因此，GCLC基因表達水平將很大程度影響體內(nèi)GSH的含量。本課題組前期的研究通過轉(zhuǎn)錄因子分析軟件分析發(fā)現(xiàn)，人GCLC基因上游-790~-766區(qū)域內(nèi)有AP-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本實驗將對AP-2（-784~-770）結(jié)合元件及NF-κB（-790~-785）結(jié)合元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行進一步的研究，有助于在分子生物學(xué)水平了解GSH的變化機制。 目的 分析人GCLC基因上游-790~-766區(qū)域內(nèi)AP-2（-784~-770）元件及NF-κB（-790~-785）元件的作用，探索其可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。從而部分闡明GSH水平變化的機制，為在分子生物水平闡明肺疾病發(fā)病機制提供一定的理論基礎(chǔ)。方法 1設(shè)計四種含突變AP-2元件（-784~-770）的基因片段（-790~-766），并人 工合成對應(yīng)的突變探針。采用電泳遷移率分析(EMSA)實驗觀察突變探針是否能與核蛋白特異性結(jié)合，并用超級遷移率實驗（Supershiftassay）檢測突變探針是否能與轉(zhuǎn)錄因子AP-2和NF-κB的抗體結(jié)合。2運用重疊PCR技術(shù)對AP-2元件（-784~-770）進行定點突變。并構(gòu)建能 表達蟲熒光素酶報告基因的突變型質(zhì)粒。3將野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒分別與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染16HBE細 胞，檢測轉(zhuǎn)染后蟲熒光素酶活性值，以判斷突變AP-2元件對人GCLC基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果 1經(jīng)過EMSA及Supershift試驗篩選出其中一種含突變AP-2元件（-784~ -770）的基因片段（-790~-766）能與16HBE細胞核蛋白結(jié)合，但不能與轉(zhuǎn)錄因子AP-2抗體結(jié)合。 2經(jīng)測序鑒定，，突變AP-2載體符合預(yù)期設(shè)計，成功構(gòu)建。 3將成功構(gòu)建的突變AP-2質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染16HBE細胞后檢測蟲熒光素酶活性值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變AP-2（-784~-770）質(zhì)粒較野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性明顯下降(P＜0.01)，說明人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域AP-2元件（-784~-770）具有正性轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。 結(jié)論 1人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-790~-766bp區(qū)間內(nèi)有轉(zhuǎn)錄因子AP-2及NF-κB的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。 2人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游的AP-2結(jié)合元件（-784~-770）具有正性轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。
【關(guān)鍵詞】：谷胱甘肽 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位（GCLC） 基因突變 AP-2元件 人支氣管上皮細胞（16HBE）
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R56
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 中英文對照詞匯表9-11
• 前言11-15
• 第一部分 人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域（-790~-766）的AP-2元件和NF-κB元件的實驗研究15-28
• 材料和方法15-22
• 1. 實驗材料15-17
• 1.1 細胞株及細胞培養(yǎng)液15
• 1.2 主要試劑15-16
• 1.3 主要儀器設(shè)備16
• 1.4 主要溶液的配制16-17
• 1.4.1 細胞培養(yǎng)液16
• 1.4.2 細胞裂解液16
• 1.4.3 5×TBE儲備液16-17
• 1.4.4 馬來酸緩沖液17
• 1.4.5 20×SSC17
• 1.4.6 Washing緩沖液17
• 1.4.7 Detection緩沖液17
• 1.4.8 10×封閉液（blocking solution）17
• 1.4.9 抗體溶液（antibody solution）17
• 2. 實驗方法17-22
• 2.1 16HBE（人支氣管上皮）細胞系的復(fù)蘇及培養(yǎng)17-19
• 2.1.1 細胞的復(fù)蘇17-18
• 2.1.2 細胞的傳代18
• 2.1.3 細胞的凍存18-19
• 2.2 電泳遷移率變動分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)19-22
• 2.2.1 EMSA的基本原理19
• 2.2.2 16HBE細胞核蛋白的提�。ㄋ胁襟E都在冰上進行）19-20
• 2.2.3 探針的合成、退火、反應(yīng)體系的構(gòu)建20-21
• 2.2.4 電泳21
• 2.2.5 電轉(zhuǎn)膜21-22
• 2.2.6 發(fā)光檢測：先準備工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）1222
• 結(jié)果22-25
• 討論25-28
• 第二部分 人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域（-784~-770）的AP-2元件突變載體的功能分析28-40
• 材料和方法28-36
• 1. 主要材料28-30
• 1.1 質(zhì)粒和菌株28
• 1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)液28
• 1.3 主要試劑28-29
• 1.4 主要儀器設(shè)備29
• 1.5 主要溶液的配制29-30
• 1.5.1 LB培養(yǎng)液29
• 1.5.2 LB固體培養(yǎng)基29-30
• 2. 實驗方法30-36
• 2.1 人GCLC基因上游（-784~-770）調(diào)控序列突變AP-2熒光素酶報告載體的構(gòu)建30-34
• 2.1.1 引物設(shè)計30
• 2.1.2 兩輪PCR擴增并構(gòu)建突變AP-2報告載體30-34
• 2.2 轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性分析34-35
• 2.2.1 16HBE細胞培養(yǎng)同第一部分34
• 2.2.2 雙報道質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染16HBE細胞34-35
• 2.2.3 熒光素酶活性檢測35
• 2.3 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學(xué)處理35-36
• 結(jié)果36-38
• 討論38-40
• 結(jié)論40-41
• 致謝41-42
• 參考文獻42-47
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果47-48
• 綜述48-54
• 參考文獻52-54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鄒國明;李冰;冉丕鑫;;人支氣管上皮細胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶催化亞單位基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[J];中國病理生理雜志;2008年08期

本文編號：1025065