本文關(guān)鍵詞：miR-9調(diào)控MYOCD在肝肺綜合征相關(guān)PASMCs表型轉(zhuǎn)換及異常增殖中的機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景和目的:肝肺綜合征(Hepatopulmonary syndrome,HPS)是一種致死性的終末期肝病相關(guān)并發(fā)癥,其典型三聯(lián)征為進(jìn)行性慢性肝病(chronic liver diseases,CLD),肺內(nèi)微血管擴(kuò)張(intra-pulmonary microvascular dilation,IPVD)和難治性低氧血癥(serious hypoxemia)。其在慢性肝病患者中的發(fā)病率較高(約為4%-47%),生存率較低(約為41%)。到目前為止,除了原位肝移植(liver transplantation,LT)肝肺綜合征仍缺乏有效治療。我們前期研究發(fā)現(xiàn)肝肺綜合征大鼠血清能夠刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的表型轉(zhuǎn)換和異常增殖,兩者作為肝肺綜合征相關(guān)肺血管重建(pulmonary vascular remodeling,PVR)的典型病理變化具有重要的研究?jī)r(jià)值。心肌素蛋白(myocardin,MYOCD)作為血清應(yīng)答因子(serum response factor,SRF)的轉(zhuǎn)錄水平激動(dòng)劑,參與促進(jìn)平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)相關(guān)表型基因表達(dá);抑制細(xì)胞周期。研究證實(shí),心肌素蛋白在心臟及大量成熟平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)。近來(lái)研究表明,心肌素蛋白在肺血管重建及多種增殖性血管疾病中發(fā)揮調(diào)控作用。microRNAs(miRNAs)作為一種非編碼RNA,通過(guò)降解/轉(zhuǎn)錄抑制mRNA進(jìn)而負(fù)性調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。這種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控參與影響多種生物學(xué)過(guò)程,例如:細(xì)胞增殖及分化;特定細(xì)胞類型功能;多種心血管疾病。自從2007年第一篇關(guān)于miRNA調(diào)控VSMCs的文章發(fā)表后,相繼miR-143/145,miR-21和miR-20a被證實(shí)在VSMCs生物學(xué)的多個(gè)方面發(fā)揮作用。然而,在HPS相關(guān)PVR中microRNA/MYOCD信號(hào)通路的調(diào)控作用尚不明確。因此,本研究擬探索是否存在miRNAs通過(guò)靶向調(diào)控MYOCD參與HPS的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)研究方法(分為四步):1.構(gòu)建體內(nèi)CBDL動(dòng)物模型及體外PASMCs模型采用慢性膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation,CBDL)法構(gòu)建大鼠HPS模型;從CBDL大鼠體內(nèi)提取動(dòng)脈血并制備血清。原代PASMCs細(xì)胞從正常SD大鼠體內(nèi)提取,DMEM(低糖)+10%胎牛血清培養(yǎng),4-9代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.生物信息學(xué)分析;CBDL大鼠血清刺激下PASMCs內(nèi)預(yù)測(cè)miRNAs、myocardin、分化表型相關(guān)蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達(dá)水平檢測(cè)運(yùn)用相關(guān)生物信息學(xué)軟件(Targetscan、miRanda和miRDB)預(yù)測(cè)靶向調(diào)控MYOCD mRNA 3’-UTR的miRNAs.正常大鼠血清或CBDL大鼠血清分別干預(yù)PASMCs24h(T1)、48h(T2)、72h(T3)后,qRT-PCR法檢測(cè)選取的miRNAs(miR-1、miR-9、miR-128和miR-186)及myocardin mRNA的表達(dá)水平。Western blotting法檢測(cè)myocardin和分化表型相關(guān)蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達(dá)水平。3.miR-9的功能性分析PASMCs轉(zhuǎn)染miR-9抑制劑,Western blotting法檢測(cè)myocardin和分化表型相關(guān)蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達(dá)水平。進(jìn)而,采用qRT-PCR法和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-9與MYOCD的靶向調(diào)控關(guān)系。4.miR-9/MYOCD信號(hào)通路的功能性分析PASMCs分別轉(zhuǎn)染miR-9抑制劑/MYOCD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。Western blotting法檢測(cè)分化表型相關(guān)蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達(dá)水平;3H-Td R和CCK-8法檢測(cè)PASMCs的增殖水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.CBDL大鼠血清上調(diào)PASMCs內(nèi)miR-9表達(dá)水平,下調(diào)myocardin mRNA及蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)PASMCs表型轉(zhuǎn)換。CBDL大鼠血清刺激下miR-9表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性上調(diào)(2.8-、4-and 5.2 fold),miR-1上調(diào)(2-fold),miR-128及186表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變;myocardin mRNA及蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性下調(diào);PASMCs內(nèi)分化表型相關(guān)蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性下調(diào)。2.miR-9參與調(diào)控CBDL大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)換。miR-9抑制劑有效上調(diào)CBDL大鼠血清刺激下PASMCs內(nèi)myocardin和分化表型相關(guān)蛋白(SM-α-actin、SM-MHC)的表達(dá)水平。3.miR-9靶向調(diào)控MYOCD mRNA。qRT-PCR法和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí),miR-9通過(guò)直接靶向結(jié)合MYOCD mRNA 3’-UTR調(diào)控其表達(dá)。4.miR-9/MYOCD信號(hào)通路參與調(diào)控CBDL大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)換及異常增殖。miR-9抑制劑/MYOCD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒均有效抑制CBDL大鼠血清刺激下PASMCs的表型轉(zhuǎn)換及異常增殖。結(jié)論:miR-9通過(guò)靶向調(diào)控MYOCD參與介導(dǎo)CBDL大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)換及異常增殖。
【關(guān)鍵詞】：肝肺綜合征 慢性膽總管結(jié)扎 microRNA 心肌素蛋白 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.3;R563
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 構(gòu)建體內(nèi)CBDL大鼠模型和體外PASMCs細(xì)胞模型18-26
• 2.1 構(gòu)建體內(nèi)CBDL大鼠模型和體外PASMCs細(xì)胞模型18-26
• 2.1.1 材料和方法18-22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-24
• 2.1.3 討論24-26
• 第三章 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)及初步檢測(cè)26-34
• 3.1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)及初步檢測(cè)26-34
• 3.1.1 材料和方法26-30
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-33
• 3.1.3 討論33-34
• 第四章 miR-9/MYOCD信號(hào)通路在肝肺綜合征大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)換和異常增殖中的作用和機(jī)制研究34-51
• 4.1 肝肺綜合征大鼠血清誘導(dǎo)PASMCs表型轉(zhuǎn)換34-40
• 4.1.1 材料與方法34-37
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-39
• 4.1.3 討論39-40
• 4.2 miR-9 參與調(diào)控肝肺綜合征大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)換的影響40-43
• 4.2.1 材料與方法40-41
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-42
• 4.2.3 討論42-43
• 4.3 miR-9 通過(guò)直接靶向結(jié)合MYOCD mRNA 3’-UTR調(diào)控其表達(dá)43-46
• 4.3.1 材料與方法43-44
• 4.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-45
• 4.3.3 討論45-46
• 4.4 miR-9/MYOCD信 號(hào)通路參與調(diào)控肝肺綜合征大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)換和異常增殖46-51
• 4.4.1 材料與方法46-47
• 4.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 4.4.3 討論49-51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-60
• 文獻(xiàn)綜述 microRNA和lncRNA:血管損傷和重塑的重要調(diào)控因子60-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果68-69
• 致謝69

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