本文關(guān)鍵詞：卵巢癌SKOV3中Holoclone細(xì)胞的特性及其形成血管生成擬態(tài)的能力

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【摘要】：目的:血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是高侵襲性的腫瘤細(xì)胞所具有的自我血供的微循環(huán)結(jié)構(gòu),利用人卵巢上皮性癌細(xì)胞株SKOV3分離培養(yǎng)3種不同形態(tài)的單細(xì)胞克隆,比較其體內(nèi)成瘤能力及體外克隆形成能力,并計(jì)算克隆形成率(colony forming efficiency,CFE);觀察其形成VM的能力;并檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9的表達(dá)水平。方法:1通過有限稀釋法對SKOV3進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)形成3種不同形態(tài)的單細(xì)胞克隆:全克隆(holoclone)、部分克隆(meroclone)、亞克隆(paraclone);Holoclone細(xì)胞緊密排列體積小,圓形或橢圓形,具有連續(xù)傳代、無限增殖等干細(xì)胞特性;Paraclone細(xì)胞形狀不規(guī)則,松散,可能為終末分化細(xì)胞;Meroclone介于holoclone和paraclone之間。取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞,用梯度倍數(shù)稀釋的原則,將細(xì)胞懸液連續(xù)倍數(shù)稀釋至極低密度(每個(gè)96孔板中含0.5-1個(gè)細(xì)胞)。次日,挑選并標(biāo)記只含1個(gè)細(xì)胞的孔;培養(yǎng)10-14天后孔中即形成較大克隆,區(qū)分并標(biāo)記各種形態(tài)不同的細(xì)胞克隆。繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2體內(nèi)成瘤能力的試驗(yàn):將30只雌性裸鼠(BALB/c-nu)隨機(jī)分成3組分別接種3種不同形態(tài)的細(xì)胞。無菌條件下,將holoclone細(xì)胞計(jì)數(shù)1000個(gè),meroclone細(xì)胞和paraclone細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為1×105個(gè),分別重懸于0.2ml PBS中,接種于裸鼠右側(cè)大腿皮下,觀察裸鼠皮下成瘤情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn):制備單細(xì)胞懸液,將holoclone,meroclone,paraclone分別接種在軟瓊脂上,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2~3周。鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆,并計(jì)算CFE。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。4三維細(xì)胞培養(yǎng):將holoclones細(xì)胞,meroclones和paraclones細(xì)胞分別接種于用于進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)的人工基底膜基質(zhì)膠Matrigel上。利用倒置相差顯微鏡隨機(jī)取上、下、左、右、中心5個(gè)視野,間隔相同的時(shí)間觀察VM形成情況,并拍照記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。5 Western Blot方法檢測MMP-2、MMP-9和CD133的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果:1細(xì)胞單克隆的篩選將SKOV3細(xì)胞利用有限稀釋法將稀釋的細(xì)胞接種于96孔板。接種24 h后,挑選并標(biāo)記只含有1個(gè)細(xì)胞的孔。繼續(xù)培養(yǎng)10-14d后,區(qū)分細(xì)胞克隆的形態(tài)及分類并計(jì)數(shù)(此部分實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)人進(jìn)行確認(rèn))。Holoclone細(xì)胞均呈圓形或橢圓形,細(xì)胞密集整齊排列,形態(tài)規(guī)則,其所含的細(xì)胞體積小,胞漿較少,無明顯偽足或突起。Paraclone細(xì)胞形狀不規(guī)則,松散,體積也較大,細(xì)胞含有豐富的胞漿,可見明顯偽足或突起。Meroclone形態(tài)位于holoclone和paraclone中間,不如holoclone規(guī)則,內(nèi)部的細(xì)胞排列相對均勻,體積也較小,細(xì)胞排列趨向松散,周邊的細(xì)胞可以出現(xiàn)偽足。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算3種克隆的平均比例,holoclone為17.4±0.8%,meroclone為30.1±0.4%,paraclone為52.5±1.1%。在相同培養(yǎng)條件下,觀察10周左右,holoclone可以快速增殖,連續(xù)傳代,meroclone及paraclone大部分消失。觀察12周左右,holoclone仍保持快速增值,可以連續(xù)傳代,僅存的小部分meroclone及paraclone全部發(fā)生凋亡或無法繼續(xù)傳代。觀察16周左右holoclone的形態(tài)與母系SKOV3細(xì)胞形態(tài)相似,呈對數(shù)生長。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用培養(yǎng)12周之前的細(xì)胞。2體內(nèi)成瘤能力的分析將1000個(gè)holoclone細(xì)胞接種于雌性裸鼠大腿皮下,觀察7-10天后,平均成瘤率為80%。將1×105個(gè)meroclone細(xì)胞接種于雌性裸鼠大腿皮下,持續(xù)觀察6周后,未見雌性裸鼠成瘤。將1×105個(gè)paraclone細(xì)胞接種于雌性裸鼠大腿皮下,持續(xù)觀察6周后,未見雌性裸鼠成瘤。3克隆形成率軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Holoclone細(xì)胞CFE為16.7±3.8%;meroclone細(xì)胞CFE為6.5±1.5%;但paraclone細(xì)胞CFE非常低,僅僅為1.2±0.7%(P0.05)。Holoclone細(xì)胞CFE比meroclone細(xì)胞和paraclone細(xì)胞CFE約增加二倍至十倍。4三種單細(xì)胞克隆形成VM的能力在三維細(xì)胞培養(yǎng)條件下,holoclone在6 h即形成典型的VM管狀樣結(jié)構(gòu),12 h達(dá)到高峰,72 h后此結(jié)構(gòu)開始松散凋落。然而meroclone和paraclone未形成VM。5 Western blot方法檢測CD133及MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)Holoclone組CD133蛋白表達(dá)水平顯著高于母系SKOV3組,同時(shí)也高于meroclone和paraclone組(P0.05 F=33.524)。Holoclone組MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著高于母系SKOV3組,同時(shí)也高于meroclone和paraclone組(P0.05 F=11.641)。Holoclone組MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著高于母系SKOV3組,同時(shí)也高于meroclone和paraclone組(P0.05 F=14.336),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中不同單細(xì)胞克隆在形態(tài)和分化上存在異質(zhì)性,其中holoclone細(xì)胞具有較高的體內(nèi)成瘤率及體外克隆形成率,且高表達(dá)CD133,具有腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞特性。2 Holoclone具有形成VM能力,為卵巢惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)提供充足的血液供應(yīng),其機(jī)制可能與MMPs誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重塑及腫瘤的高侵襲力有關(guān),有助于深入理解卵巢癌侵襲及復(fù)發(fā)的機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：卵巢上皮性癌 單細(xì)胞克隆 血管生成擬態(tài) 三維細(xì)胞培養(yǎng) 基質(zhì)金屬蛋白酶
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-25
• 附圖25-29
• 附表29-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-36
• 綜述 腫瘤干細(xì)胞與血管生成擬態(tài)關(guān)系的研究36-48
• 參考文獻(xiàn)42-48
• 致謝48-49
• 個(gè)人簡歷49

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本文編號：916968