本文關(guān)鍵詞：人臍血單個核細胞移植改善雌鼠壓力性尿失禁的實驗研究

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【摘要】：壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是一種常見的盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD),世界范圍內(nèi)約有2億人存在尿失禁問題。SUI與盆底和尿道薄弱有關(guān),婦女分娩時的肌肉組織、結(jié)締組織和神經(jīng)損傷可能是導(dǎo)致該疾病最重要的危險因素。引起壓力性尿失禁的主要機制有尿道高活動性和固有括約肌功能障礙(intrinsic sphincter deficiency,ISD)。目前多數(shù)研究者認為大多壓力性尿失禁患者同時有ISD和尿道高活動性兩種因素存在,ISD在SUI的發(fā)病過程中起重要作用[1-3]。一位有80年壽命的女性一生中可能要承受11.1%的盆底手術(shù)風(fēng)險,其中29%至少經(jīng)歷一次手術(shù)。15年后,這個風(fēng)險相似,約12.2%,其中19%有再次手術(shù)風(fēng)險,6.2%接受了再次手術(shù)[4]�；诿绹囊唤M數(shù)據(jù)也證明,80年壽命的女性一生中可能要承受20%的盆底手術(shù)或者尿失禁手術(shù)的風(fēng)險[5]。尿道懸吊帶術(shù)和尿道旁填充術(shù)作為初始尿失禁(urinary incontinence,UI)的外科治療方法已經(jīng)被認可。但是,前者有30%再次手術(shù)的風(fēng)險,后者是前者的9倍。即便手術(shù)達到85%~90%的成功率,也意味著有10%~15%的手術(shù)患者仍然持續(xù)的尿失禁,而且還有吊帶侵蝕、梗阻和感染等發(fā)生。目前治療尿失禁的方法多只能解決膀胱頸支撐功能障礙和改善尿道局部壓力,不能糾正ISD,因此長期療效不理想,而且并發(fā)癥較多。利用干細胞修復(fù)和增強受損括約肌的功能,是目前治療SUI的新思路。臍血干細胞(umbilical cord blood stem cell,UCBSC)主要含有造血干細胞和間充質(zhì)干細胞,經(jīng)體外培養(yǎng)可以分化為多種細胞,并且在臨床上已經(jīng)得到運用。UCBSC免疫原性較弱,可以為異體細胞移植所用。臍血是一種非常有潛力的干細胞資源,隨著臍血庫的建立及規(guī)范化管理,臍血有望成為將來干細胞移植治療SUI的最可靠和最穩(wěn)定的細胞來源。臍血單個核細胞(human cord blood mononuclear cells,HCMNCs)含有UCBSC,是一多異質(zhì)性細胞群,能分泌多種細胞因子(cytokines,CKs),因此,可能是一種理想的細胞移植的來源。本實驗?zāi)康脑谟谘芯縃CMNCs移植至SUI大鼠近端尿道后,觀察受損尿道組織內(nèi)的細胞分布和尿道組織解剖形態(tài)學(xué)的變化,以及檢測SUI大鼠控尿能力的改變,探討移植細胞對有isd的尿道括約肌的修復(fù)和功能重建作用。本研究以sprague-dawley雌性大鼠為研究對象,采用反復(fù)陰道擴張的方法模擬產(chǎn)道損傷建立雌性sd大鼠sui模型,利用密度梯度離心法分離出hcmncs;檢測和鑒定sui模型;培養(yǎng)并標(biāo)記hcmncs,于sui大鼠模型移植注射標(biāo)記的細胞,觀察移植細胞的分布及尿道組織形態(tài)的變化,以及sui模型尿控的改變。主要實驗方法及結(jié)果如下:一、動物分組、sui模型建立和尿道組織解剖研究40只雌鼠用于研究,分為模擬組(sham)10只和實驗組(即陰道擴張組,vd)30只,實驗組包括細胞移植治療組(t)15只,實驗對照組(c)15只。實驗組大鼠麻醉后,消毒會陰部,然后放置經(jīng)潤滑的8-frfoley尿管入陰道內(nèi),4/0絲線縫合固定在陰道外口,3ml生理鹽水注入氣囊,經(jīng)過2小時陰道擴張,抽出氣囊鹽水,拔出尿管,7天后重復(fù)擴張一次。模擬組只置入導(dǎo)尿管而不擴張。結(jié)果:所建模型的功能檢測中噴嚏試驗均為陽性,并且尿動力學(xué)檢測數(shù)據(jù)發(fā)生變化;再則,模型雌鼠陰裂變長,同時尿道組織形態(tài)提示尿道括約肌受損[6]。二、人臍血單個核細胞分離、培養(yǎng)及標(biāo)記無菌條件下取臍帶血50~100ml,6小時內(nèi)分離,采用密度梯度離心法分離出單個核細胞,l-dmem培養(yǎng),采用不同標(biāo)記物標(biāo)記,觀察細胞生長情況。結(jié)果:分離的臍血單個核細胞培養(yǎng)后細胞胞體增大,呈紡錘形、梭形細胞和團簇樣細胞。brdu(5-溴脫氧尿核苷)及dapi(4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)可標(biāo)記上細胞。三、hcmncs移植及檢測移植后sui模型尿控的改善和尿道括約肌的改變1.經(jīng)dapi標(biāo)記的hcmncs注射進模型鼠尿道周圍,取近端尿道組織切片,于激光掃描共聚焦顯微鏡(confocallaserscanningmicroscope,clsm)下觀察到dapi染色陽性的移植細胞較均勻的分布于尿道周圍肌肉,表明移植的hcmncs在尿道括約肌內(nèi)存活,部分染色陽性的細胞形態(tài)呈扁平狀,并參與到肌內(nèi)的組成。2.通過染色,我們發(fā)現(xiàn)陰道擴張后尿動力學(xué)數(shù)據(jù)的改善與尿道括約肌組織的恢復(fù)有關(guān)。細胞移植后見大鼠尿道括約肌肌層明顯增厚,實驗對照組(c)尿道控尿能力和組織形態(tài)隨時間亦逐漸恢復(fù),但是,與細胞移植治療組(t)比較,尿控改善略差,組織恢復(fù)較慢[6]。結(jié)論:本研究成功地分離培養(yǎng)和標(biāo)記了hcmncs,通過反復(fù)擴張陰道模擬女性生產(chǎn)時陰道擴張的損傷,建立了sd雌鼠壓力性尿失禁模型,證明了移植的臍血單個核細胞可在受損尿道括約肌內(nèi)存活、分布,移植hcmncs能促使尿道括約肌得以較好的修復(fù),壓力性尿失禁大鼠控尿能力明顯改善,為臍血干細胞移植治療壓力性尿失禁提供了理論支持。
【關(guān)鍵詞】：尿失禁 壓力性 臍血單個核細胞 干細胞 移植
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R711.59
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 雌鼠SUI模型的建立和尿道括約肌組織研究14-24
• 2.1 雌鼠SUI模型的建立14-18
• 2.1.1 材料與方法14-16
• 2.1.2 結(jié)果16-18
• 2.2 尿道括約肌組織研究18-22
• 2.2.1 材料與方法18-20
• 2.2.2 結(jié)果20-22
• 2.3 討論22-24
• 第三章 HCMNCs移植治療SUI的實驗研究24-39
• 3.1 人臍血單個核細胞分離、培養(yǎng)及標(biāo)記24-30
• 3.1.1 材料與方法24-28
• 3.1.2 結(jié)果28-30
• 3.2 HCMNCs移植后SUI模型尿控的改善和尿道括約肌改變30-36
• 3.2.1 材料與方法30-33
• 3.2.2 結(jié)果33-36
• 3.3 討論36-39
• 全文總結(jié)39-40
• 參考文獻40-43
• 文獻綜述 基于細胞的治療策略于壓力性尿失禁的研究進展43-49
• 參考文獻47-49
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文49-50
• 致謝50

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本文編號：732264